Memoria para optar al título de Bioquímico / La enfermedad neurológica conocida como Paraparesia Espástica Tropical, mielopatía
asociada al HTLV-I (TSP/HAM) se caracteriza por la degeneración axonal de los haces
córtico-espinales. Aunque no se conoce mucho como el HTLV-I afecta selectivamente a los
axones más largos del sistema nervioso central (SNC), es la proteína viral Tax secretada
desde los linfocitos T-CD4+ el principal candidato por su actividad estimuladora de
factores transcripcionales a través de varias vías de señalización. Esta proteína, se encuentra
presente en forma crónica en el líquido cefalorraquídeo (LCR), pudiendo alterar el
transporte axonal actuando extracelularmente, siendo afectados principalmente los axones
más largos por su mayor vulnerabilidad.
Estudios in vitro de la proteína Tax muestran que se une a varias proteínas celulares
que regulan vías relacionadas con la transcripción y el citoesqueleto, incluyendo fosfatasas
y quinasas, por lo que se sugiere que en esta patogenia podría haber un desbalance en el
nivel de fosforilación/desfosforilación de las proteínas del citoesqueleto.
Se han propuesto como biomarcadores de varias enfermedades neurodegenerativas los
niveles de Tau total y/o fosfo-Tau en el LCR. Por lo tanto, los objetivos de esta
investigación fueron comparar la fosforilación de Tau presente en el LCR de pacientes con
TSP/HAM y sujetos controles, a fin de aclarar si estas proteínas están involucradas en la
patogenia de esta enfermedad, y aislar la proteína Tau desde el LCR para posteriores
estudios de proteómica de sus fosfoformas.
Los niveles de Tau en el LCR y la evaluación del patrón molecular de fosforilación de
residuos específicos como Tre181, Ser199, Tre205, Tre231, Ser262, Ser356, Ser396,
Ser404 y Ser422 fue realizada por “immunowestern blot” utilizando anticuerpos policlonales monoespecíficos. Con todos los anticuerpos ensayados se observó la presencia
de una banda principal de 52 kDa.
Los niveles de Tau en el LCR de los TSP/HAM no fueron significativamente distintos
de los de controles, y aunque no fue significativamente diferente (p = 0,06), se podría
sugerir sólo una anormal hiperfosforilación de Tre181. Si se confirmara este mayor nivel
fosforilación en Tre181 trabajando con un número mayor de pacientes o utilizando otros
métodos más confiables, sugeriría un aumento en la actividad o una sobre-expresión de dos
quinasas dirigidas a Ser/Tre-Pro, GSK3-α y β, Cdk5.
Una caracterización completa de la fosforilación de los distintos residuos de Tau en el
LCR de los controles y pacientes con TSP/HAM requirió la aplicación adicional de la
técnica analítica de Espectrometría de Masas (MS). Por lo tanto, se trató de aislar Tau
desde LCR utilizando una columna de afinidad por fosfopéptidos de Ga(III), y dos métodos
de inmunoprecipitación, uno usando proteínas A/G acopladas a agarosa y una segunda con
unión covalente de los anticuerpos (“Sepharose” activada con CNBr). Ni la columna de
Ga(III) ni el primer método de inmunoprecipitación fueron adecuados para posterior
análisis por MS. Después de demostrar por SDS/PAGE que el método que usaba los
anticuerpos unidos covalentemente mostraba una banda principal de 52 kDa, se eluyó la
proteína del gel, tripsinizó y analizó por MS MALDI-TOF. Se observó la posible presencia
de proteínas asociadas al citoesqueleto que podrían haber coinmunoprecipitados con Tau.
Estos resultados no fueron confirmatorios por el bajo “score” observado.
En conclusión, dos de los resultados muestran diferencias entre TSP/HAM y varias
enfermedades neurodegenerativas: el no aumento en los niveles de Tau total, y la posible hiperfosforilación de sólo Tre181. Fue importante lograr aislar Tau desde el LCR para
futuros estudios de MS / The neurological disorder known as tropical spastic paraparesis / HTLV-I-associated
myelopathy (TSP/HAM) is characterized by axonal degeneration of the cortico-spinal
tracts. Although the selectivity of HTLV-I towards the longest axons of the central nervous
system (CNS) is not fully understood, the main candidate is the secreted viral protein Tax
from lymphocytes T-CD4+ that shows a stimulatory activity of transcriptional factors
acting through several signaling pathways is the main candidate. This protein, chronically
present in CSF, could extracellularly alter axonal transport. The longest axons are mainly
affected because they are more vulnerable.
In vitro studies on Tax protein have shown the binding of this protein to many cellular
proteins that regulate transcription and cytoskeleton related pathways including
phosphatases and kinases, therefore an imbalance in the level of cytoskeleton
phosphorylated/unphosphorylated proteins could be involved in this pathogeny.
Levels of total Tau and/or phospho-Tau in the CSF have been proposed as biomarkers
of various neurodegenerative diseases. Hence, the aims of this investigation were to
compare Tau phosphorylation present in CSF of TSP/HAM patients and control subjects, to
elucidate if these proteins are involved in the pathogeny of this disease, and to isolate Tau
protein from CSF for further proteomic studies of its phosphoforms.
Levels of Tau in CSF and evaluation of the molecular pattern of phosphorylation of
selected residues such as Thr181, Ser199, Thr205, Thr231, Ser262, Ser356, Ser396, Ser404 and Ser422 were performed by immunowestern blot, using monospecific polyclonal
antibodies. With all the antibodies tested we observed a main band with 52 kDa. The CSF
levels of Tau in TSP/HAM were not significantly different from those of controls. Only an
abnormal hyperphosphorylation on Thr181, although it was not significantly different (p =
0.06), could be suggested in TSP/HAM patients. If a high phosphorylation level in Thr181
is confirmed by working with a larger number of patients or other more reliable methods, it
would suggest an increase in activity or over-expression of two Ser/Thr-pro-directed
kinases GSK3-α and β, and Cdk5.
A complete characterization of Tau phosphorylation sites in CSF from control and
TSP/HAM patients required the use of the additional analytical technique of Mass
Spectrometry (MS). Therefore, we tried to isolate Tau from CSF samples using the
phosphopeptide affinity column with Ga(III), and two immunoprecipitation methods, one
using protein A/G-coupled agarose beads and a second one with covalently bound
antibodies (Sepharose activated with CNBr). Neither the Ga(III) column nor the first
immunoprecipitation method were adequated for MS analysis. After demonstrating by
SDS/PAGE that the method that used covalently bound antibodies showed a main band of
52 kDa, the sample was eluted, trypsinized and analyzed in a Mass Spectrometer MALDITOF.
This preliminary study suggested the presence of Tau and of some other cytoskeleton
associated proteins that could have been coimmunoprecipited with Tau. The low “score”
obtained did not allow reach confirmatory results.
In conclusions, two of the results showed differences with various neurodegenerative
diseases: lack of changes in Tau levels in CSF, and possible hyperphosphorylation of only threonine 181. It was important to have been able to isolate a Tau form from CSF for
further studies of MS
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/105485 |
| Date | January 2006 |
| Creators | Ortiz Riaño, Emilio Javier |
| Contributors | Kettlun Maluk, Ana María, Valenzuela Pedevila, María Antonieta, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular |
| Publisher | Universidad de Chile, Programa Cybertesis |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Ortiz Riaño, Emilio Javier |
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