Les champignons mycorhiziens à arbuscules (CMA), classés dans le phylum Glomeromycota, ne peuvent pas être facilement identifiés par la morphologie de leurs spores et leurs mycélia à l'intérieur ou à l'extérieur des racines de leurs hôtes. Ce problème fondamental d'identification rend l'étude de leur diversité, en particulier dans leur habitat naturel (sol et racine) extrêmement difficile.
Les gènes ribosomaux ont été largement utilisés pour développer des amorces spécifiques et en inférer des arbres phylogénétiques. Cependant, ces gènes sont très polymorphes et
existent en plusieurs copies dans le génome des CMA, ce qui complique l’interprétation des résultats.
Dans notre étude, nous avons étudié le polymorphisme intra- et inter-spécifique du gène β-tubuline, présent en faible nombre de copies dans le génome des CMA, afin d’obtenir de
nouvelles séquences nucléotidiques pour développer des marqueurs moléculaires. Les
gènes β-tubuline amplifiés à partir de l'ADN génomique de cinq espèces du genre Glomus
ont été clonés et séquencés. L’analyse des séquences indique un polymorphisme intraspécifique chez trois espèces de CMA. Deux séquences paralogues très variables ont été nouvellement identifiées chez les G. aggregatum, G. fasciculatum et G. cerebriforme.
Aucun polymorphisme n’a été détecté chez les G. clarum et G. etunicatum. Toutes les
séquences montrent la présence de deux introns hautement variables. La majorité des
substitutions ont été localisées dans les exons et sont synonymes à 90%. La conservation des acides aminés suggère un niveau élevé de sélection négative sur le gène β-tubuline et
nous permet de confirmer que les CMA représentent un ancien groupe fongique (400
million d’années). L’analyse phylogénétique, réalisée avec vingt et une séquences
nucléotidiques du gène β-tubuline, a révélé que les séquences des Glomaceae forment un
groupe monophylétique bien supporté, avec les Acaulosporaceae et Gigasporaceae comme
groupe frère. Les séquences paralogues nouvellement identifiées chez les G. aggregatum et G. fasciculatum n'ont pas été monophylétiques au sein de chaque espèce. Les
oligonucléotides ont été choisis sur la base des régions variables et conservées du gène β-tubuline. Le test PCR des amorces β-Tub.cerb.F/ β-Tub.cerb.R a révélé des bandes
spécifiques de 401 pb pour les séquences paralogues du G. cerebriforme. Deux paires
d’amorces ont été développées afin d’identifier les séquences du groupe nommé Tub.1. Les tests PCR nous ont permis d’identifier certaines séquences du groupe Tub.1. Une paire d’amorce β-Tub.2.F/ β-Tub.2.R nous a permis d’identifier certaines séquences paralogues du groupe nommé Tub.2.
L’analyse d’autres gènes combinée à celle du gène β-tubuline permettra le développement
de marqueurs moléculaires plus spécifiques pour l’identification de CMA. / Arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) are classified in the phylum Glomeromycota. This
fungal group cannot be easily identified using morphology of their spores and hyphae
inside or outside plant-roots. This fundamental problem renders the study of their diversity extremely difficult, particularly in their natural habitat (soil and roots).
The ribosomal genes have been widely used to develop specific primers and to infer
phylogenetic trees. However, these genes are highly polymorphic and exist in multiple
copies in the genome of the AMF. This leads misinterpretation of the results.
In our study, we analysed the intra- and inter specific polymorphism of the β-tubulin gene, which is present in low copy number in AMF genome, to obtain further nucleotide
sequences to develop molecular markers.
β-tubulin genes were sequenced from genomic DNA of five Glomus species. PCR amplified β-tubulin genes were cloned and sequenced. Intra- and inter-specific polymorphism analyses indicate the polymorphic nature of β-tubulin gene in three AMF species. Two highly variable β-tubulin paralogs were newly identified in G. aggregatum,
G. fasciculatum and G. cerebriforme. No evidence for the presence of paralogs was found in G. clarum and G. etunicatum. All AMF sequences show the presence of two introns, which are highly variable. The majority of substitutions are located in the exons and 90% are synonymous. The conservation of amino-acids level suggests a high level of negative selection acting on the β-tubulin gene and allows us to consider that the AMF represent an ancient fungal group (400 million years). A phylogenetic analysis, carried out with twentyone
β-tubulin nucleotidic sequences, revealed that the sequences of Glomeraceae form a
highly supported monophyletic group with Acaulosporaceae and Gigasporaceae as sistergroup.
The newly identified paralogs from G. aggregatum and G. fasciculatum were not
found to be monophyletic within each species. Oligonucleotides were designed in the conserved and variable regions. PCR amplification test of β-Tub.cerb.F / β-Tub.cerb.R revealed specific bands of 401 bp for the G. cerebriforme paralogs. Two pairs of primers were developed to identify sequences of the group named Tub.1. PCR tests have allowed us
to identify certain sequences of Tub.1 group. A primer pair of β-Tub.2.F / β-Tub.2.R we identified some sequences paralogous group named Tub.2. Analysis of other genes combined with that of β-tubulin gene enable the development of more specific molecular markers for AMF identification.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/3262 |
| Date | 10 1900 |
| Creators | Zeramdini, Nadia |
| Contributors | Hijri, Mohamed, St-Arnaud, Marc |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Thèse ou Mémoire numérique / Electronic Thesis or Dissertation |
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