Caractérisation de NEF-sp: une exoribonucléase 3'→ 5' spécifique du testicule. Les études biochimiques et génétiques ont révélé que de nombreuses protéines jouent un rôle important dans la voie des ARNpi (ARN interagissant avec Piwi). Néanmoins, certaines caractéristiques mécanistes ne sont pas encore complètement comprises. D’autre part, certaines protéines impliquées dans la voie des ARNpi pourraient ne pas encore être caractérisées. Lorsque ce projet a commencé, le traitement 3’ des ARNpi n'avait pas été complètement identifié. Par contre la directionnalité 3’ à 5’ avait été observée avec une dépendance au Mg2+. Toutefois, la protéine responsable du raccourcissement des ARNpi à leur longueur mature n'était toujours pas connue.NEF-sp devrait être une exo nucléase d'ARN avec une directionnalité de 3' à 5'. Sa prédiction de domaine a révélé que cela se compose d'un domaine de nucléase N-terminal et de deux motifs de reconnaissance d'ARN (RRM). NEF-sp est également prévue comme une nucléase spécifique aux testicules, mais son rôle biologique n'a pas été caractérisé auparavant. Ce projet s'est concentré sur une hypothèse initiale selon laquelle NEF-sp pourrait potentiellement agir comme une nucléase impliquée dans la voie des ARNpi.Globalement, nous avons démontré que NEF-sp humaine est une exoribonucléase avec une directionnalité 3'→ 5'qui est active sur les substrats de l'ARN simple brin. Cette protéine est exprimée exclusivement dans les testicules des souris. En plus, NEF-sp pourrait fonctionner dans le compartiment nucléaire. Notre analyse de la souris Nef-sp mutante n'a révélé aucun phénotype évident. Nous avons observé que les homozygotes des deux sexes sont viables et présentent une fertilité normale. De plus, NEF-sp ne semble pas jouer un rôle dans la voie des ARNpi. Il est possible que le recadrage du/des substrat(s) inconnu(s) ne soit pas important pour la viabilité et fertilité en raison de la compensation potentielle par d'autres nucléases. Néanmoins, notre étude fournit une caractérisation biochimique et génétique de l'exoribonucléase NEF-sp des mammifères. / Genetic and biochemical studies have identified more than twenty different proteins involved in the piRNA pathway. However, some mechanistic features are still not fully understood. When this project started, piRNAs 3' end trimming was not completely characterized. Trimming was observed before in BmN4 cells and an Mg2+-dependent 3′ to 5′ exonuclease was implicated in this process. However, the protein responsible for shortening piRNAs to their mature length was still not known.NEF-sp is predicted to be an RNA exonuclease with 3′ to 5′ directionality. This protein is composed by three domains: a nuclease domain at N-terminal and two RNA binding motifs at C-terminal. NEF-sp is also predicted to be a testis-specific nuclease, however its biological role was not previously characterized. This project was based on the hypothesis that NEF-sp could potentially act as a nuclease involved in the piRNA maturation.We examined the biochemical properties of the uncharacterized mammalian nuclease family member NEF-sp. We show that Nef-sp transcripts are detected exclusively in mouse testes. We demonstrate that hNEF-sp is a 3ʹ→5ʹ exoribonuclease that is active on ssRNA substrates and likely functions in the nucleolar compartment. Our own analysis of the Nef-sp mouse knock-out mutant revealed no obvious phenotype. We observed that homozygous animals of both sexes are viability and display normal fertility. NEF-sp does not seem to play a role in piRNA pathway. It is possible that precise trimming of the unknown substrate(s) may not be important for viability/fertility due to potential complementation by other nucleases. Nevertheless, our study provides a biochemical and genetic characterization of the mammalian NEF-sp exoribonuclease.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2017GREAV042 |
| Date | 29 June 2017 |
| Creators | Moreira Da Silva, Sara |
| Contributors | Grenoble Alpes, Pillai, Ramesh |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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