INTRODUÇÃO: A exposição a níveis elevados de pressão sonora é a segunda causa mais comum de perda auditiva sensorioneural adquirida. Está relacionada à morte celular por apoptose, necrose e/ou necrose programada (necroptose) devido ao dano mecânico e/ou metabólico, ocasionando a degeneração de estruturas cocleares como células ciliadas, sobretudo externas, células de suporte e de fibras aferentes do nervo coclear. Estudos têm demostrado um aumento na citocina inflamatória TNFa após a exposição ao ruído, bem como a melhoria auditiva relacionada ao uso de etanercepte, que é um bloqueador destacitocina. Neste contexto, este estudo teve por objetivo avaliar o efeito do silenciamento gênico do Tnfa na audição de ratos Wistar, expostos ao ruído branco, e identificar o perfil de expressão gênica na via metabólica desse gene. METODOLOGIA: Foram incluídos ratos Wistar do sexo masculino, jovens com limiar auditivo no Peate clique de 50 dBSPL. Os animais foram submetidos à introdução do siRNA Tnfa em uma orelha, e siRNA scramble na orelha contralateral por via trans-timpânica com posterior exposição à 120 dBSPL de ruído branco por 3h. Foi realizado Peate clique e remoção das cócleas para obtenção do cDNA e avaliação da expressão gênica da via metabólica do Tnfa por meio de qRT-PCR. Um grupo de animais, não submetidos ao silenciamento, foi exposto ao ruído para análise dessa via metabólica. Para o cálculo da expressão gênica relativa (Rq) utilizamos o método do deltaCT comparativo e o teste t-Student pareado para avaliar os parâmetros no Peate clique. RESULTADOS: A taxa de silenciamento observada foi de 74,1%. A média do limiar eletrofisiológico nas orelhas silenciadas foi estaticamente melhor que a orelha scramble (p < 0,001) com valores médios de 49,5 +- 10.5. A amplitude média da onda I em 80 dBSPL e das ondas II e IV em 90 dBSPL foi estatisticamente maior na orelha siRNA Tnfa, sem alteração na latência nas intensidades audíveis,para ambos os lados. A exposição ao ruído promoveu aumento da expressão do gene Tnfa e de seu receptor Tnfrsf1A, 24h após à exposição, associado ao aumento da expressão de genes relacionados à apoptose e diminuição de genes relacionados à sobrevida celular. CONCLUSÃO: O ruído promoveu aumento de expressão do gene Tnfa e de genes envolvidos na apoptose, associado à perda auditiva em modelo experimental. A administração trans-timpânica do siRNA Tnfa promoveu preservação do limiar eletrofisiológico e da amplitude da onda I, II e IV no Peate clique, após exposição ao ruído intenso, sugerindo que a inibição deste pode ser uma estratégia de preservação auditiva promissora. O silenciamento do Tnfa inibiu a disfunção coclear após estímulo acústico, sugerindo que esta proteína é um dos principais agentes envolvidos na perda auditiva induzida pelo ruído, devendo ser considerada como alvo terapêutico na estratégia de preservação auditiva / INTRODUCTION: Exposure to high levels of sound pressure is the second most common cause of acquired sensorineural hearing loss. It is related to cell death through apoptosis, necrosis and/or programmed necrosis (necroptosis) due to mechanical and/or metabolic damage, causing the degeneration of cochlear structures, such as cilliary cells, mainly external, as well as support cells and afferent fibers of the cochlear nerve. Studies have demonstrated an increase in the inflammatory cytokine TNFalfa after exposure to noise, as well as auditory improvement related to the use of etanercept, a cytokine blocker. In this context, this study aimed to evaluate the effect of Tnfa gene silencing on the hearing of Wistar rats exposed to white noise and to identify the expression profile in the metabolic pathway of this gene. METHODOLOGY: Young male Wistar rats with 50 dBSPL threshold in auditory brainstem responses click (ABR) were included in this study and submitted to the introduction of the TnfasiRNA in one ear and the scramble siRNA in the contralateral ear by trans-tympanic route, with subsequent exposure to 120 dB SPL of white noise for 3h. ABR was measured and the cochleae were dissected and used for the extraction of total RNA to obtain cDNA and conduct evaluations of the Tnfa metabolic pathway gene expression by qRT-PCR. A group of animals, not submitted to silencing, was exposed to noise to analyze this metabolic pathway. The relative gene expression (Rq) was calculated by the comparative deltaCT method and the paired Student t-test were applied to evaluate the parameters of the ABR click. RESULTS: The silencing rate was 74.1%. The mean electrophysiological threshold in the silenced ears was statistically higher than the scrambled ear (p < 0.001) with mean values of 49.5 +- 10.5. The mean amplitudes of wave I at 80 dBSPL and waves II and IV at 90dBSPL were statistically higher in the TnfasiRNA ear, with no change in latency at audible intensities for both sides. Noise exposure promoted increased expression of the Tnfa gene and its receptor, Tnfrsf1A, 24h after exposure, associated with increased expression of genes related to apoptosis and decreased expression of genes related to cell survival. CONCLUSIONS: Noise exposure promoted increased in Tnfa gene expression as well as in genes involved in apoptosis, associated with hearing loss in an experimental model. The trans-tympanic administration of TnfasiRNA promotes the preservation of the electrophysiological threshold and the amplitude of wave I, II and IV in the ABR click, after exposure to intense noise, suggesting that this inhibition may be a promising auditory preservation strategy. The Tnfa knockdown inhibited cochlear dysfunction after acoustic injury, suggesting that this protein plays an important role in noise induced hearing loss and should be considered a therapeutic target in auditory preservation strategies
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-07112018-132314 |
| Date | 23 May 2018 |
| Creators | Rodrigues, Janaina Candida |
| Contributors | Brito Neto, Rubens Vuono de, Mandelbaum, Karina Lezirovitz |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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