La leucémie aigüe myéloïde est un cancer hautement létal notamment parce que le taux de rechutes est élevé, ce qui traduit l’importance du développement de nouvelles thérapies. Ces dernières peuvent tirer avantage du fait que les cellules leucémiques peuvent exprimer des antigènes qui ne sont pas exprimés par les tissus sains, soit les antigènes spécifiques aux tumeurs (TSA). À cet effet, nos collaborateurs ont découvert une source importante « d'aberrantly expressed TSA » (aeTSA) dans les régions non codantes de l’ADN. Ces aeTSA sont présentés par les molécules de CMH I et plusieurs ont provoqué la réactivité des lymphocytes T (LTs) in vitro. En plus d'être spécifiques aux cellules cancéreuses, ces aeTSA sont partagés entre plusieurs patients ce qui fait d'eux des cibles intéressantes dans le cadre d’immunothérapies. Sachant que c’est le récepteur de cellules T (TCR) qui confère la spécificité aux LTs, le but est d'isoler et de caractériser des TCR anti-aeTSA en vue de leur utilisation comme outils thérapeutiques.
Pour ce faire, l’expansion de LTs CD8+ naïfs provenant de donneurs sains a été réalisée grâce à une co-culture avec des cellules dendritiques autologues chargées avec l'aeTSA d’intérêt. Les LTs CD8+ spécifiques du aeTSA ont été triés à l’aide d'un marquage dextramères et l’ARN a été isolé afin de réaliser le séquençage du TCR. Ce dernier a révélé que le répertoire de TCR anti-aeTSA est nettement oligoclonal, facilitant l'identification des séquences des chaînes α et β des clonotypes les plus abondants. En revanche, les répertoires de TCR anti-LMP2 426-434 (antigène viral) et anti-WT1 37-45 (antigène associé aux tumeurs) étaient plus diversifiés. De plus, des tests d'avidité fonctionnelle réalisés à l'aide d'ELISpot en concentrations décroissantes de peptides ont révélé que l'avidité fonctionnelle des LTs qui reconnaissent les aeTSA est similaire à celle du peptide LMP2 426-434, ce qui suggère que les aeTSA stimulent des réponses T de hautes avidités.
Ensuite, la délétion du TCR endogène a été réalisée à l'aide de la technique CRISPR-Cas9, montrant plus de 90% d'efficacité. À des fins d'optimisation de protocoles, le TCR 1G4 spécifique de NY-ESO-1 a été introduit dans le locus TRAC et, simultanément, le knock-out de la chaîne α du TCR endogène a été réalisé afin de limiter les mésappariements et la compétition entre ces deux TCR. Les prochaines étapes seront d’introduire le gène codant pour le TCR spécifique d'aeTSA dans des LTs et de vérifier que les cellules éditées sont réactives envers ces aeTSA. Finalement, ce projet pourrait ouvrir la voie au ciblage d'aeTSA à l’aide de l’ingénierie du TCR pour rediriger un grand nombre de LTs envers les cellules leucémiques. / Acute myeloid leukemia is a highly lethal cancer for which effective immunotherapies are actively sought. These immunotherapies can take advantage of the fact that leukemia cells can express antigens that are not expressed by healthy tissues, namely tumor-specific antigens (TSA). In this regard, our collaborator's team has discovered an important source of aberrantly expressed TSA (aeTSA) in the non-coding regions of DNA. These aeTSAs are presented by MHC 1 molecules and can elicit T cells reactivity in vitro. In addition to being specific to cancer cells, these aeTSAs are shared between several patients, which makes them interesting targets in the context of immunotherapies. Knowing that the T cell receptor (TCR) is responsible for T cells specificity, the goal is to isolate and characterize anti-aeTSA TCRs for their use as therapeutic tools.
To this end, we expanded aeTSA-specific T cells from naive CD8+ T cells obtained from healthy donors through co-culture with autologous dendritic cells loaded with the relevant aeTSA. The aeTSA-specific CD8+ T cells identified by dextramer staining were sorted for RNA extraction TCR sequencing. Amplicon sequencing reveals that the expanded anti-aeTSA TCR repertoire is markedly oligoclonal, facilitating the identification of dominant TCR α and β chains. In contrast, the anti-LMP2 426-434 (viral antigen) and anti-WT1 37-45 (tumor-associated antigen) TCR repertoires were more diverse. In addition, functional avidity tests, performed using ELISpot in decreasing concentrations of peptides, revealed that the functional avidity of T cells recognizing aeTSA is similar to LMP2 426-434 peptide, suggesting that aeTSAs stimulate high-avidity responses. Then, endogenous TCR knock-out was performed using the CRISPR-Cas9 technique, showing more than 90% efficiency. For protocol optimization purposes, the 1G4 TCR specific for NY-ESO-1 was introduced into the TRAC locus and, simultaneously, the knock-out of the α chain of the endogenous TCR was achieved in order to limit mismatches and competition between these two TCRs. The next steps will be to introduce the gene coding for the aeTSA-specific TCR into T cells and to validate that the edited cells are reactive toward these aeTSAs. Ultimately, this project could pave the way for targeting aeTSAs using TCR engineering to redirect large numbers of T cells toward leukemic cells.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/28411 |
| Date | 08 1900 |
| Creators | Aubin, Marie-France |
| Contributors | Delisle, Jean-Sébastien |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | fra |
| Detected Language | French |
| Type | thesis, thèse |
| Format | application/pdf |
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