A acidose metabólica causa perda de mineral ósseo e a estimulação mecânica causa remodelamento ósseo adaptativo. A reabsorção óssea que caracteriza essas mudanças ósseas depende da acidificação extracelular pela secreção vetorial de H+ pelos osteoclastos. A H+-ATPase vacuolar em paralelo com o trocador Cl-/H+ (CLC7) são os mecanismos conhecidos envolvidos na reabsorção óssea, entretanto, os osteoclastos também expressam canais para H+ dependentes a voltagem. Este trabalho foi realizado para avaliar a contribuição dos canais para H+ na função celular visando à compreensão de seu relacionamento com a H+-ATPase vacuolar e o CLC7 (1); analisar se o fluxo de fluido extracelular modifica a secreção de H+ (2) e avaliar a diferenciação dos osteoclastos in vitro sob acidose metabólica devido à redução do HCO3- (3). Osteoclastos de ratos Wistar foram obtidos diretamente dos animais ou foram diferenciados in vitro (com M-CSF e RANKL) e semeados sobre vidro, plástico ou substratos mineralizados em <font face=\"Symbol\">α-MEM + 10% SFB, em pH 7,4 ou 6,9, e então mantidos em incubadora com 5% CO2, a 37<font face=\"Symbol\">°C. A diferenciação celular foi avaliada pela contagem de células TRAP-positivas ou de núcleos marcados por DAPI. A secreção de H+ foi avaliada por epifluorescência, utilizando-se BCECF-AM, sensível a pH. Os registros do pH intracelular foram feitos na vigência de soluções tamponadas por HEPES, na ausência de CO2/HCO3- (pH 7,4, 300 mOsm/L H2O, a 37<font face=\"Symbol\">°C), na presença ou ausência de perfusão contínua de fluido extracelular a uma velocidade de 5 ml/min. Na ausência de perfusão, os osteoclastos exibiram variações cíclicas do pHi (acidificação e alcalinização espontâneas), com período de 12 a 45 minutos (n = 35) e amplitude de 0,12 a 1,43 unidades de pHi. As oscilações não foram abolidas por concanamicina (100 mM) (n = 3), por NPPB (100 <font face=\"Symbol\">mM) (n = 3), na ausência de Na+ extracelular (n = 5) ou na ausência de Cl- extracelular (n = 3). O fluxo de fluido aboliu as oscilações e a ausência de Cl- extracelular modificou significativamente seu padrão. Na ausência de perfusão, a secreção de H+ após acidificação intracelular induzida foi abolida por Zn2+ (100 <font face=\"Symbol\">mM) (n = 5). Além disso, na presença de perfusão, a secreção de H+ após acidificação intracelular induzida foi abolida por NPPB (n = 4) e não foi abolida por bafilomicina (200 nm) (n = 3). A acidose metabólica não modifica o número de osteoclastos diferenciados in vitro, entretanto, o tratamento das culturas com Zn2+ causou redução do numero de células mononucleares e aumento relativo do número de osteoclastos multinucleados em relação ao controle tanto em pH 7,4 quanto em pH 6,9. / Metabolic acidosis can cause a loss of bone mineral and the mechanic stimulation can cause adaptative bone remodeling. The bone resorption characteristic of these bone changes aforementioned depends on the extracellular acidification by osteoclastmediated proton secretion. The H+ secretion by vacuolar H+-ATPase together with Clsecretion through a Cl-/H+ exchanger (CLC7) are the known mechanisms involved in the bone resorption; however, osteoclasts also express voltage-gated proton channels. The proposed aims of these work were to evaluate the contribution of proton channels in the osteoclast function for better understanding its relation with vacuolar H+-ATPase and CLC7 (1); to analyze whether the flow of extracellular fluid modifies the H+ secretion or not (2); and to analyse the osteoclast differentiation in vitro under metabolic acidosis due to HCO3- reduction (3). Osteoclasts were freshly isolated or generated from bone marrow precursor cells (using M-CSF and RANK- L) from of Wistar rats. The cells were placed on glass coverslips, plastic coverslips, or on mineralized substrate in <font face=\"Symbol\">α-MEM + 10% FBS, pH 7.4 or 6.9, and then maintained in a 5% CO2 incubator at 37<font face=\"Symbol\">°C. The differentiation was analyzed by counting of TRAP-stained cells or DAPIstained nuclei. The H+ secretion was analysed by epifluorescence, using the pHsensitive dye BCECF-AM. The intracellular pH record was done using a standard HEPES-buffered solution free of CO2/HCO3- (pH 7.4, 300 mOsm/L H2O, at 37<font face=\"Symbol\">°C), with or without continuous perfusion of extracellular fluid at a rate of 5 ml/min. In the absence of perfusion, the osteoclasts exhibit cyclic pHi variations (spontaneous acidification and alkalinization), with a period of 12 to 45 minutes (n = 35) and amplitude difference between maximal and minimal pHi of 0.12 to 1.43 units pHi. These oscillations were not abolished in the presence of oncanamycin (100 mM) (n = 3), NPPB (100 <font face=\"Symbol\">mM) (n = 3), in the absence of Na+ (n = 5) or in the absence of Cl- (n = 3) in the extracellular solution. The fluid flow itself abolished the pH oscillations and the absence of extracellular Cl- modifies significantly these patterns. In the absence of perfusion, the H+ secretion after induced intracellular acidification was abolished by Zn2+ (100 <font face=\"Symbol\">mM) (n = 5). In addition, in the presence of perfusion, the H+ secretion after induced intracellular acidification was abolished by NPPB (n = 4) and was not abolished by bafilomycin (200 nm) (n = 3). Metabolic acidosis does not modify the number of osteoclasts differentiated in vitro, however, when the cell culture was treated with Zn2+, there was a significant reduction in the number of mononuclear cells and a relative increase in the number of multinucleated osteoclasts compared to control, both in pH 7.4 and pH 6.9 medium.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-10022012-115635 |
| Date | 26 October 2011 |
| Creators | Morethson, Priscilla |
| Contributors | Aziz, Raif Musa |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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