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Óxido nítrico e periodontite experimental: caracterização de mediadores intracelulares da atividade osteoclastogênica, conseqüências locais e sistêmicas. / Nitric oxide and experimental periodontitis: characterization of intracellular mediators of osteoclastogenic activity, local and systemic consequences.Herrera, Bruno Schneider 07 August 2008 (has links)
A doença periodontal é a doença crônica mais prevalente nas doenças orais. Dentre os mediadores desse processo contam-se a Resolvina E1 (RvE1), um mediador pró-resolução da inflamação capaz de diminuir a perda óssea secundária á doença periodontal em coelhos, e o oxido nítrico (NO), o qual pode ser produzido em grandes quantidades pela ação de citocinas e estimular a diferenciação e atividade osteoclástica. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos da RvE1 em osteoclastos (OCs) em cultura e os mecanismos envolvidos, bem como o papel do NO na progressão da periodontite experimental em ratos e as alterações sistémicas resultantes de danos oxidativos. A diferenciação de OCs foi induzida em células de medula óssea de camundongos C57BL/6 em cultura (7 dias) e tratadas com diferentes doses de RvE1. NFkB e Akt fosforilada foram analisadas por Western blotting e a expressão gênica de NO sintase (NOS) induzível (iNOS) por \"real-time\" PCR. A participação dos receptores ChemR23 e BLT-1 na resposta à RvE1 foi estudada em membranas isoladas de OCs empregando radioligantes. A perda óssea alveolar e danos em órgãos periféricos foram analisados em ratos com periodontite induzida por ligadura (P) e sob tratamento de longo prazo com o inibidor não-seletivo de NOS, L-NAME. Os animais receberam L-NAME durante as 2 semanas prévias à indução da periodontite e até o momento do sacrifício (3, 7 ou 14 após a ligadura). A perda óssea alveolar foi avaliada radiograficamente, e análises do conteúdo de proteínas contendo nitrotirosina (NT), espécies reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARs) e atividade da mieloperoxidase (MPO) foram realisadas em amostras de coração, baço, rim, fígado e pulmão. RvE1 (3 ng/mL) através da ativação do receptor para BLT-1 (mas não ChemR23) inibiu a diferenciação e atividade de OCs (p<0,05) após 5 ou 7 dias de cultura, assim como a fosforilação dos dois sítios da Akt e a traslocação do NF-<font face=\"symbol\">kB para o núcleo, um evento chave tanto na diferenciação de OCs (p<0,05) como na diminuição da expressão de iNOS. In vivo, ratos P (dia 7) mostraram um aumento na expressão de NT cardíaca e MPO renal em comparação ao grupo Sham (S; p<0,05). L-NAME resultou em aumento de NT hepática no grupo P no dia 3 (p<0,05), mas diminuição da NT cardíaca no dia 7 (p<0,01). Em comparação ao grupo P, ratos P+LN mostraram um aumento significativo na MPO hepática, cardíaca e renal no dia 3 (p<0,05), mas diminuição de MPO (dia 7) e TBARs esplênico (dia 3, p<0,05). Em resumo, mostramos que a RvE1 ligando-se ao receptor para BLT-1 inibe a diferenciação e atividade de OCs interferindo com a sinalização de Akt e NF-<font face=\"symbol\">kB, e consequentemente inibindo a expressão da iNOS, e que o NO tem um papel central na periodontite, não só relacionado a consequências locais na perda óssea alveolar, como também em órgãos periféricos distantes. / The periodontal disease is the most prevalent chronic disease in oral diseases. Among the mediators of this process, is the Resolvin E1 (RvE1), a novel mediator pro-resolving of inflammation that is capable to decrease alveolar bone loss secondary to periodontal disease in rabbits; and the nitric oxide (NO), that can be produced in large amount, induced by cytokines and it can stimulate the osteoclast differentiation and activity. The aim of this study is to investigate the effects of RvE1 on osteoclasts (OCs) culture and the pathway involved, also the role of NO in the progression of experimental periodontitis in rats and systemic alterations due to oxidative damage. The OCs differentiation was induced in bone marrow cell culture from C57BL/6 mice (7 days) and treated with various doses of RvE1. NF<font face=\"symbol\">kB and Akt phosphorylation were analyzed with Western blotting and the genic expression of NO synthase (NOS) inducible (iNOS) with \"Real Time\" PCR. The role of receptors ChemR23 and BLT-1 was accessed in OCs isolated membranes performing radioligants. The alveolar bone loss and peripheral organ damage was assessed in rats with ligature-induced periodontitis (P) under a long-term treatment of a NOS inhibitor, L-NAME. The animals received L-NAME from two weeks prior to periodontitis induction and until their sacrifice (3, 7 and 14 days after ligature). The alveolar bone loss was evaluated radiographically, and the protein nitrotyrosine (NT) content, reactive species of thiobarbituric acid (TBARs) and myeloperoxidase activity (MPO) were analyzed in samples of heart, spleen, kidney, lungs and kidneys. RvE1 (3 ng/mL) trough BLT-1 receptor activation (but not ChemR23) inhibits the OCs differentiation and activity (p<0.05) after 5 or 7 days of the culture, as well as the Akt phosphorylation and NF-<font face=\"symbol\">kB translocation to the nucleus, a key event both in OCs differentiation (p<0.05) and iNOS expression decreases. In vivo, P rats (day 7) show an increase of heart NT and renal MPO, but lower lung MPO activity in comparison to the Sham group (S; p<0.05). L-NAME leads to an increase the liver NT expression in P rats on day 3 (p<0.05), but decreases the cardiac NT on day 7 (p<0.01). In comparison with the P group, P+LN rats showed significantly increased liver, heart and kidney MPO content on day 3 (p<0.05), but lower lung MPO (day 7) and spleen TBARs (day 3) content (p<0.05). In summary we have shown that RvE1 binding on BLT-1 receptor inhibits OCs differentiation and activity by interfering with Akt and NF-<font face=\"symbol\">kB signaling and consequently iNOS inhibition, and NO has a central role on periodontitis, not only related to the local consequences on alveolar bone resorption, but also on distant peripheral organs.
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Óxido nítrico e periodontite experimental: caracterização de mediadores intracelulares da atividade osteoclastogênica, conseqüências locais e sistêmicas. / Nitric oxide and experimental periodontitis: characterization of intracellular mediators of osteoclastogenic activity, local and systemic consequences.Bruno Schneider Herrera 07 August 2008 (has links)
A doença periodontal é a doença crônica mais prevalente nas doenças orais. Dentre os mediadores desse processo contam-se a Resolvina E1 (RvE1), um mediador pró-resolução da inflamação capaz de diminuir a perda óssea secundária á doença periodontal em coelhos, e o oxido nítrico (NO), o qual pode ser produzido em grandes quantidades pela ação de citocinas e estimular a diferenciação e atividade osteoclástica. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos da RvE1 em osteoclastos (OCs) em cultura e os mecanismos envolvidos, bem como o papel do NO na progressão da periodontite experimental em ratos e as alterações sistémicas resultantes de danos oxidativos. A diferenciação de OCs foi induzida em células de medula óssea de camundongos C57BL/6 em cultura (7 dias) e tratadas com diferentes doses de RvE1. NFkB e Akt fosforilada foram analisadas por Western blotting e a expressão gênica de NO sintase (NOS) induzível (iNOS) por \"real-time\" PCR. A participação dos receptores ChemR23 e BLT-1 na resposta à RvE1 foi estudada em membranas isoladas de OCs empregando radioligantes. A perda óssea alveolar e danos em órgãos periféricos foram analisados em ratos com periodontite induzida por ligadura (P) e sob tratamento de longo prazo com o inibidor não-seletivo de NOS, L-NAME. Os animais receberam L-NAME durante as 2 semanas prévias à indução da periodontite e até o momento do sacrifício (3, 7 ou 14 após a ligadura). A perda óssea alveolar foi avaliada radiograficamente, e análises do conteúdo de proteínas contendo nitrotirosina (NT), espécies reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARs) e atividade da mieloperoxidase (MPO) foram realisadas em amostras de coração, baço, rim, fígado e pulmão. RvE1 (3 ng/mL) através da ativação do receptor para BLT-1 (mas não ChemR23) inibiu a diferenciação e atividade de OCs (p<0,05) após 5 ou 7 dias de cultura, assim como a fosforilação dos dois sítios da Akt e a traslocação do NF-<font face=\"symbol\">kB para o núcleo, um evento chave tanto na diferenciação de OCs (p<0,05) como na diminuição da expressão de iNOS. In vivo, ratos P (dia 7) mostraram um aumento na expressão de NT cardíaca e MPO renal em comparação ao grupo Sham (S; p<0,05). L-NAME resultou em aumento de NT hepática no grupo P no dia 3 (p<0,05), mas diminuição da NT cardíaca no dia 7 (p<0,01). Em comparação ao grupo P, ratos P+LN mostraram um aumento significativo na MPO hepática, cardíaca e renal no dia 3 (p<0,05), mas diminuição de MPO (dia 7) e TBARs esplênico (dia 3, p<0,05). Em resumo, mostramos que a RvE1 ligando-se ao receptor para BLT-1 inibe a diferenciação e atividade de OCs interferindo com a sinalização de Akt e NF-<font face=\"symbol\">kB, e consequentemente inibindo a expressão da iNOS, e que o NO tem um papel central na periodontite, não só relacionado a consequências locais na perda óssea alveolar, como também em órgãos periféricos distantes. / The periodontal disease is the most prevalent chronic disease in oral diseases. Among the mediators of this process, is the Resolvin E1 (RvE1), a novel mediator pro-resolving of inflammation that is capable to decrease alveolar bone loss secondary to periodontal disease in rabbits; and the nitric oxide (NO), that can be produced in large amount, induced by cytokines and it can stimulate the osteoclast differentiation and activity. The aim of this study is to investigate the effects of RvE1 on osteoclasts (OCs) culture and the pathway involved, also the role of NO in the progression of experimental periodontitis in rats and systemic alterations due to oxidative damage. The OCs differentiation was induced in bone marrow cell culture from C57BL/6 mice (7 days) and treated with various doses of RvE1. NF<font face=\"symbol\">kB and Akt phosphorylation were analyzed with Western blotting and the genic expression of NO synthase (NOS) inducible (iNOS) with \"Real Time\" PCR. The role of receptors ChemR23 and BLT-1 was accessed in OCs isolated membranes performing radioligants. The alveolar bone loss and peripheral organ damage was assessed in rats with ligature-induced periodontitis (P) under a long-term treatment of a NOS inhibitor, L-NAME. The animals received L-NAME from two weeks prior to periodontitis induction and until their sacrifice (3, 7 and 14 days after ligature). The alveolar bone loss was evaluated radiographically, and the protein nitrotyrosine (NT) content, reactive species of thiobarbituric acid (TBARs) and myeloperoxidase activity (MPO) were analyzed in samples of heart, spleen, kidney, lungs and kidneys. RvE1 (3 ng/mL) trough BLT-1 receptor activation (but not ChemR23) inhibits the OCs differentiation and activity (p<0.05) after 5 or 7 days of the culture, as well as the Akt phosphorylation and NF-<font face=\"symbol\">kB translocation to the nucleus, a key event both in OCs differentiation (p<0.05) and iNOS expression decreases. In vivo, P rats (day 7) show an increase of heart NT and renal MPO, but lower lung MPO activity in comparison to the Sham group (S; p<0.05). L-NAME leads to an increase the liver NT expression in P rats on day 3 (p<0.05), but decreases the cardiac NT on day 7 (p<0.01). In comparison with the P group, P+LN rats showed significantly increased liver, heart and kidney MPO content on day 3 (p<0.05), but lower lung MPO (day 7) and spleen TBARs (day 3) content (p<0.05). In summary we have shown that RvE1 binding on BLT-1 receptor inhibits OCs differentiation and activity by interfering with Akt and NF-<font face=\"symbol\">kB signaling and consequently iNOS inhibition, and NO has a central role on periodontitis, not only related to the local consequences on alveolar bone resorption, but also on distant peripheral organs.
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Estudo da expressão das moléculas reguladoras da remodelação do osso alveolar durante a movimentação ortodôntica com força contínua em ratos tratados com alendronato sódico / Study of expression of regulatory molecules of the alveolar bone remodeling during orthodontic movement with continuous force in rats treated with alendronateMarques, Natasha D'Andrea Mateus 19 October 2015 (has links)
A movimentação dentária ortodôntica ocorre através de dois processos, nos quais o osso alveolar é reabsorvido nas áreas de pressão, enquanto que novo osso é formado na área de tração. O processo de reabsorção óssea ocorre pela ação de células multinucleadas, os osteoclastos. Os bisfosfonatos constituem um grupo de fármacos com propriedade de inibir a reabsorção óssea, foi utilizado no presente estudo com a finalidade de interferir na remodelação óssea induzida ortodonticamente. Para isso, força contínua de 15 cN foi aplicada aos primeiros molares superiores de ratos machos Wistar de 2 1/2 meses, utilizando uma biomecânica com fios superelásticos. Os animais foram divididos aleatoriamente em 4 grupos: 1) O grupo controle constituído por dezoito ratos, os quais foram injetados solução salina por 7 dias antes da instalação da biomecânica passiva, que permaneceu por 3, 10 e 18 dias; 2) Dezoito animais foram tratados com ALN (dose 2,5 mg/Kg) por 7 dias antes da instalação da biomecânica passiva que permaneceu por 3, 10 e 18 dias; 3) Dezoito animais foram tratados com alendronato com a mesma dose citada acima por 7 dias antes da instalação da biomecânica ativa que permaneceu por 3, 10 e 18 dias; 4) Dezoito animais foram injetados com solução salina 7 dias antes da instalação da biomecânica ativa que permaneceu por 3, 10 e 18 dias. As maxilas foram fixadas com 4% de formaldeído + 0,1% de glutaraldeído, descalcificadas em EDTA a 4,13% e incluídas em parafina ou resina Spurr. Os cortes foram corados com HE para análise morfológica. Alguns cortes foram submetidos à imuno-histoquímica para detecção de RANKL e OPG. Foi utilizado o método TRAP, marcador de osteoclastos e microscopia eletrônica de transmissão para análise ultraestrutural. Alguns espécimes tiveram a cortical óssea vestibular do primeiro molar superior congelada em nitrogênio líquido para análise da expressão de RANKL por Western Blotting. O ALN inibiu a reabsorção óssea e radicular de todos os grupos tratados. As células clásticas apresentaram-se em estado latente. No grupo da movimentação ortodôntica o osso alveolar foi remodelado e com 18 dias a superfície radicular apresentou-se reabsorvida e o TRAP revelou clastos ativos, achados confirmados pela microscopia eletrônica de transmissão. A expressão de RANKL, molécula ativadora de células clásticas, nao foi inibida pela droga. A expressão de OPG foi aumentada nos animais tratados. Os resultados demonstram que o uso de alendronato sódico na movimentação ortodôntica não interfere no recrutamento dos osteoclasto, ele aparentemente inibe sua ativação, o que pode interferir no processo de remodelação óssea e talvez diminua a quantidade de movimentação dentária. / Orthodontic tooth movement occurs through two processes in which the alveolar bone is resorbed in the pressure areas, whereas new bone is formed in the tension area. The bone resorption occurs by multinucleated cell, the osteoclasts. The bisphosphonates are drugs with capability to inhibit clastic activity were used in the present study in order to interfere with the bone remodeling induced orthodontic. For this continuous force of 15 cN was applied to the first molars of Wistar male rats of 2 1/2 months, using a biomechanical with superelastic wire. The animals were randomly divided into 4 groups: 1) The control group consisted of eighteen mice, which received sterile saline solution saline for 7 days prior to installation of passive biomechanics, which remained for 3, 10 and 18 days; 2) Eighteen animals were treated with ALN (dose 2.5 mg / kg) for 7 days prior to installation of the passive biomechanical to remain for 3, 10 and 18 days; 3) Eighteen animals were treated with alendronate with the same dose quoted above for 7 days prior to the biomechanical installation that remains active for 3, 10 and 18 days; 4) Eighteen animals were injected with sterile saline solution 7 days prior to the biomechanical installation that remains active for 3, 10 and 18 days. The maxillae were fixed with 4% formaldehyde + 0.1% glutaraldehyde, decalcified in EDTA 4.13% and embedded in paraffin or Spurr resin. The specimens were morphologically analyzed in HE stained sections. Some stained sections were used for immunolabeling for RANKL and OPG. The osteoclasts were marked by tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) histochemistry. The ultrathin sections were examined in a trasnmission electron micrsocpe. Some specimens were frozen in liquid nitrogen for protein extraction and Western Blotting protein expression analyzes. The ALN inhibited bone resorption and root of all the treated groups. The clastic cells present in a latent state. In the orthodontic movement group alveolar bone was remodeled with 18 days to root surface presented itself reabsorbed and the TRAP revealed clasts assets, findings confirmed by transmission electron microscopy. Expression of RANKL activating molecule clastic cells was not inhibited by the drug. The OPG expression was increased in treated animals. The results demonstrate that the use of alendronate in the orthodontic movement does not interfere with osteoclast recruitment, it apparently inhibits their activation, which can interfere in the bone remodeling process and may reduce the amount of tooth movement.
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Estudo do efeito de bisfosfonatos nas células clásticas durante a ossificação endocondral do joelho de ratos e em cultura primária: abordagens morfológicas e moleculares. / Study of bisphosphonate effects on clastic cells during endochondral ossification in the rat knee and in primary cultures: morphological and molecular approaches.Rezende, Eloiza de 06 December 2013 (has links)
Na ossificação endocondral, osteoclastos (Oc) reabsorvem os remanescentes de cartilagem, e osteoblastos (Ob) depositam matriz óssea. Bisfosfonatos (Bps) inibem a ação dos Oc. Foi avaliado o efeito dos Bps alendronato (Aln) e etidronato (Etn) em joelhos de ratos jovens (in vivo) e na cultura primária de Oc (in vitro). O material in vivo foi analisado por MEV, MET e ML (morfologia e histoquímica para TRAP). RNA foi extraído para análise por RT-PRC e proteínas para análise por WB, que também foram extraídos após o tratamento da cultura com Bps. O tratamento com Etn revelou lâmina epifiseal desorganizada com extensa área de cartilagem; a MEV mostrou pouco osso trabecular com lacunas de reabsorção, que não foram observadas com Aln. O Aln revelou numerosos Oc TRAP-positivos latentes, confirmados por MET. In vivo os Bps diminuem a expressão dos genes analisados; In vitro o Aln diminui somente a expressão de Runx2, menos expresso com Etn, assim como Spp1. A expressão proteica variou entre os grupos. Aln é o mais potente em inibir os Oc enquanto o Etn atua sobre os Ob. / In endochondral ossification, clastic cells (Oc) resorb the calcified cartilage, while osteoblasts (Ob) form new bone. Bisphosphonates (Bps) inhibit the action of Oc. The effect of the Bps alendronate (Aln) and etidronate (Etn) on the knees of young rats (in vivo) and in primary cultures of Oc (in vitro) was evaluated. The specimens were analyzed by SEM, TEM, and LM or TRAP histochemistry. RNA was extracted to analysis by RT-PRC and protein to analysis by WB. RNA and protein were also extracted after the treatment of cultures with Bps. Rats treated with Etn exhibited a disorganized epiphyseal plate containing large area of cartilage; SEM showed few bone trabeculae with resorption lacunae, which were not observed in Aln specimens. Aln showed numerous latent Oc by TRAP histochemistry and TEM. In vivo, the Bps decreased the expression of all analyzed genes; in vitro, Aln decreased only the expression of Runx2 as well as SPP1, which expression was less with Etn. Protein expression varied among the groups. Aln is more potent for inhibiting the Oc, while Etn acts on Ob.
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Cinética de expressão de moléculas co-estimulatórias de osteoclastos no desenvolvimento da doença periodontal experimental e sua modulação por citocinas / Kinetics of osteoclast co-stimulatory molecules throughout experimental periodontitis and mice and its modulation by cytokinesRepeke, Carlos Eduardo Palanch 03 October 2012 (has links)
O processo de diferenciação e ativação de osteoclastos, essencial para a manutenção da homeostasia do tecido ósseo e também envolvido na patogênese de diversas patologias caracterizadas pela atividade osteolítica, depende de um sistema central de controle que envolve a ligação das moléculas RANK/RANKL. Além do sistema RANK/RANKL, moléculas co-estimulatórias de osteoclastos, tais como os complexos DAP-12, TREM-2 e SIRP1, e FcR, OSCAR e PIR-A, também apresentam um papel importante na geração e ativação de osteoclastos. Entretanto, a possível contribuição de tais moléculas para a progressão da doença periodontal (DP) permanece desconhecida, assim como o possível impacto de citocinas na modulação de sua expressão no microambiente periodontal. Nosso objetivo foi investigar, por RealTimePCR, o padrão de expressão de moléculas co-estimulatórias de osteoclastos (DAP-12, TREM-2 e SIRP1, e FcR, OSCAR e PIR-A) na periodontite crônica em humanos, além de avaliar a cinética de expressão destas moléculas e a sua modulação por citocinas (TNF-, IFN-, IL-17 e IL-10) ao longo do curso da DP em camundongos em camundongos C57Bl/6 wild-type (WT) e geneticamente modificados (TNFp55KO, IFNKO, IL17KO, IL10KO. Nossos resultados demonstram que nas lesões periodontais crônicas a expressão de todas as moléculas co-estimulatórias de osteoclastos apresentaram-se significativamente aumentadas quando comparadas às amostras controle. Com relação à periodontite experimental, verificamos que todas as moléculas co-estimulatórias alvo apresentavam aumento em sua expressão após a indução de doença quando comparado aos controles. Nos camundongos para TNFp55KO, IFNKO e IL17KO, observamos uma redução na severidade da DP (reabsorção óssea e quantidade de células inflamatórias) e na expressão de moléculas co-estimulatórias, ao contrário do observado nos camundongos IL10KO. Entretanto, ao normalizarmos os níveis de expressão das moléculas co-estimulatórias de osteoclastos pelo número de células inflamatórias, verificamos que TNF- e IL-17 se mostram associados a uma maior expressão de moléculas co-estimulatórias, enquanto IFN- e IL-10 parecem regular negativamente a expressão de tais moléculas. Em termos gerais, demonstramos que a expressão de moléculas co-estimulatórias de osteoclastos se mostra aumentada na DP humana e experimental, e que citocinas parecem modular sua expressão por mecanismos diretos e indiretos, tais como a migração de células inflamatórias para os sítios de doença periodontal. / The osteoclast differentiation and activation are essential to bone tissue homeostasis and in the development of bone pathologies, which RANK/RANKL signaling molecules are the major osteoclastogenic factor. However, osteoclast co-stimulatory molecules, such as DAP-12, TREM-2, SIRP1, FcR, OSCAR and PIR-A, also present an important role in the osteoclastogenesis. However, the exact role and regulation of these molecules in human and mice periodontal diseases (PD) development have not completely known. Our aim was to investigate the pattern of osteoclast co-stimulatory expression (DAP-12, TREM-2, SIRP1, FcR, OSCAR and PIR-A) in human chronic periodontitis (CP), apart from analyze the kinetic of these molecules and their regulation by cytokines (TNF-, IFN-, IL-17 and IL-10) in the development of experimental periodontal disease in mice C57Bl/6 and knockout. Our results demonstrated that all osteoclast co-stimulatory molecules presented highly expressed in CP patients when compared with control. Similar results are presented about experimental PD, where all co-stimulatory molecules was presented highly expressed in infected mice when compared with control mice. We observed in TNFp55KO, IFNKO and IL17KO mice a decrease in PD scores and co-stimulatory molecules expression, the opposite of IL10KO mice. However, when we standardized the co-stimulatory molecules levels by the number of inflammatory cells, we found that TNF- and IL-17 are associated with increased expression of co-stimulatory molecules, while IFN- and IL-10 appear to negatively regulate the expression of such molecules. In conclusion, we demonstrated that osteoclast co-stimulatory molecules shown increased in human and experimental PD, and cytokines appear to modulate their expression by direct and indirect mechanisms, such as inflammatory cells migration to the PD infected tissue.
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Cinética de expressão de moléculas co-estimulatórias de osteoclastos no desenvolvimento da doença periodontal experimental e sua modulação por citocinas / Kinetics of osteoclast co-stimulatory molecules throughout experimental periodontitis and mice and its modulation by cytokinesCarlos Eduardo Palanch Repeke 03 October 2012 (has links)
O processo de diferenciação e ativação de osteoclastos, essencial para a manutenção da homeostasia do tecido ósseo e também envolvido na patogênese de diversas patologias caracterizadas pela atividade osteolítica, depende de um sistema central de controle que envolve a ligação das moléculas RANK/RANKL. Além do sistema RANK/RANKL, moléculas co-estimulatórias de osteoclastos, tais como os complexos DAP-12, TREM-2 e SIRP1, e FcR, OSCAR e PIR-A, também apresentam um papel importante na geração e ativação de osteoclastos. Entretanto, a possível contribuição de tais moléculas para a progressão da doença periodontal (DP) permanece desconhecida, assim como o possível impacto de citocinas na modulação de sua expressão no microambiente periodontal. Nosso objetivo foi investigar, por RealTimePCR, o padrão de expressão de moléculas co-estimulatórias de osteoclastos (DAP-12, TREM-2 e SIRP1, e FcR, OSCAR e PIR-A) na periodontite crônica em humanos, além de avaliar a cinética de expressão destas moléculas e a sua modulação por citocinas (TNF-, IFN-, IL-17 e IL-10) ao longo do curso da DP em camundongos em camundongos C57Bl/6 wild-type (WT) e geneticamente modificados (TNFp55KO, IFNKO, IL17KO, IL10KO. Nossos resultados demonstram que nas lesões periodontais crônicas a expressão de todas as moléculas co-estimulatórias de osteoclastos apresentaram-se significativamente aumentadas quando comparadas às amostras controle. Com relação à periodontite experimental, verificamos que todas as moléculas co-estimulatórias alvo apresentavam aumento em sua expressão após a indução de doença quando comparado aos controles. Nos camundongos para TNFp55KO, IFNKO e IL17KO, observamos uma redução na severidade da DP (reabsorção óssea e quantidade de células inflamatórias) e na expressão de moléculas co-estimulatórias, ao contrário do observado nos camundongos IL10KO. Entretanto, ao normalizarmos os níveis de expressão das moléculas co-estimulatórias de osteoclastos pelo número de células inflamatórias, verificamos que TNF- e IL-17 se mostram associados a uma maior expressão de moléculas co-estimulatórias, enquanto IFN- e IL-10 parecem regular negativamente a expressão de tais moléculas. Em termos gerais, demonstramos que a expressão de moléculas co-estimulatórias de osteoclastos se mostra aumentada na DP humana e experimental, e que citocinas parecem modular sua expressão por mecanismos diretos e indiretos, tais como a migração de células inflamatórias para os sítios de doença periodontal. / The osteoclast differentiation and activation are essential to bone tissue homeostasis and in the development of bone pathologies, which RANK/RANKL signaling molecules are the major osteoclastogenic factor. However, osteoclast co-stimulatory molecules, such as DAP-12, TREM-2, SIRP1, FcR, OSCAR and PIR-A, also present an important role in the osteoclastogenesis. However, the exact role and regulation of these molecules in human and mice periodontal diseases (PD) development have not completely known. Our aim was to investigate the pattern of osteoclast co-stimulatory expression (DAP-12, TREM-2, SIRP1, FcR, OSCAR and PIR-A) in human chronic periodontitis (CP), apart from analyze the kinetic of these molecules and their regulation by cytokines (TNF-, IFN-, IL-17 and IL-10) in the development of experimental periodontal disease in mice C57Bl/6 and knockout. Our results demonstrated that all osteoclast co-stimulatory molecules presented highly expressed in CP patients when compared with control. Similar results are presented about experimental PD, where all co-stimulatory molecules was presented highly expressed in infected mice when compared with control mice. We observed in TNFp55KO, IFNKO and IL17KO mice a decrease in PD scores and co-stimulatory molecules expression, the opposite of IL10KO mice. However, when we standardized the co-stimulatory molecules levels by the number of inflammatory cells, we found that TNF- and IL-17 are associated with increased expression of co-stimulatory molecules, while IFN- and IL-10 appear to negatively regulate the expression of such molecules. In conclusion, we demonstrated that osteoclast co-stimulatory molecules shown increased in human and experimental PD, and cytokines appear to modulate their expression by direct and indirect mechanisms, such as inflammatory cells migration to the PD infected tissue.
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Estudo da expressão das moléculas reguladoras da remodelação do osso alveolar durante a movimentação ortodôntica com força contínua em ratos tratados com alendronato sódico / Study of expression of regulatory molecules of the alveolar bone remodeling during orthodontic movement with continuous force in rats treated with alendronateNatasha D'Andrea Mateus Marques 19 October 2015 (has links)
A movimentação dentária ortodôntica ocorre através de dois processos, nos quais o osso alveolar é reabsorvido nas áreas de pressão, enquanto que novo osso é formado na área de tração. O processo de reabsorção óssea ocorre pela ação de células multinucleadas, os osteoclastos. Os bisfosfonatos constituem um grupo de fármacos com propriedade de inibir a reabsorção óssea, foi utilizado no presente estudo com a finalidade de interferir na remodelação óssea induzida ortodonticamente. Para isso, força contínua de 15 cN foi aplicada aos primeiros molares superiores de ratos machos Wistar de 2 1/2 meses, utilizando uma biomecânica com fios superelásticos. Os animais foram divididos aleatoriamente em 4 grupos: 1) O grupo controle constituído por dezoito ratos, os quais foram injetados solução salina por 7 dias antes da instalação da biomecânica passiva, que permaneceu por 3, 10 e 18 dias; 2) Dezoito animais foram tratados com ALN (dose 2,5 mg/Kg) por 7 dias antes da instalação da biomecânica passiva que permaneceu por 3, 10 e 18 dias; 3) Dezoito animais foram tratados com alendronato com a mesma dose citada acima por 7 dias antes da instalação da biomecânica ativa que permaneceu por 3, 10 e 18 dias; 4) Dezoito animais foram injetados com solução salina 7 dias antes da instalação da biomecânica ativa que permaneceu por 3, 10 e 18 dias. As maxilas foram fixadas com 4% de formaldeído + 0,1% de glutaraldeído, descalcificadas em EDTA a 4,13% e incluídas em parafina ou resina Spurr. Os cortes foram corados com HE para análise morfológica. Alguns cortes foram submetidos à imuno-histoquímica para detecção de RANKL e OPG. Foi utilizado o método TRAP, marcador de osteoclastos e microscopia eletrônica de transmissão para análise ultraestrutural. Alguns espécimes tiveram a cortical óssea vestibular do primeiro molar superior congelada em nitrogênio líquido para análise da expressão de RANKL por Western Blotting. O ALN inibiu a reabsorção óssea e radicular de todos os grupos tratados. As células clásticas apresentaram-se em estado latente. No grupo da movimentação ortodôntica o osso alveolar foi remodelado e com 18 dias a superfície radicular apresentou-se reabsorvida e o TRAP revelou clastos ativos, achados confirmados pela microscopia eletrônica de transmissão. A expressão de RANKL, molécula ativadora de células clásticas, nao foi inibida pela droga. A expressão de OPG foi aumentada nos animais tratados. Os resultados demonstram que o uso de alendronato sódico na movimentação ortodôntica não interfere no recrutamento dos osteoclasto, ele aparentemente inibe sua ativação, o que pode interferir no processo de remodelação óssea e talvez diminua a quantidade de movimentação dentária. / Orthodontic tooth movement occurs through two processes in which the alveolar bone is resorbed in the pressure areas, whereas new bone is formed in the tension area. The bone resorption occurs by multinucleated cell, the osteoclasts. The bisphosphonates are drugs with capability to inhibit clastic activity were used in the present study in order to interfere with the bone remodeling induced orthodontic. For this continuous force of 15 cN was applied to the first molars of Wistar male rats of 2 1/2 months, using a biomechanical with superelastic wire. The animals were randomly divided into 4 groups: 1) The control group consisted of eighteen mice, which received sterile saline solution saline for 7 days prior to installation of passive biomechanics, which remained for 3, 10 and 18 days; 2) Eighteen animals were treated with ALN (dose 2.5 mg / kg) for 7 days prior to installation of the passive biomechanical to remain for 3, 10 and 18 days; 3) Eighteen animals were treated with alendronate with the same dose quoted above for 7 days prior to the biomechanical installation that remains active for 3, 10 and 18 days; 4) Eighteen animals were injected with sterile saline solution 7 days prior to the biomechanical installation that remains active for 3, 10 and 18 days. The maxillae were fixed with 4% formaldehyde + 0.1% glutaraldehyde, decalcified in EDTA 4.13% and embedded in paraffin or Spurr resin. The specimens were morphologically analyzed in HE stained sections. Some stained sections were used for immunolabeling for RANKL and OPG. The osteoclasts were marked by tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) histochemistry. The ultrathin sections were examined in a trasnmission electron micrsocpe. Some specimens were frozen in liquid nitrogen for protein extraction and Western Blotting protein expression analyzes. The ALN inhibited bone resorption and root of all the treated groups. The clastic cells present in a latent state. In the orthodontic movement group alveolar bone was remodeled with 18 days to root surface presented itself reabsorbed and the TRAP revealed clasts assets, findings confirmed by transmission electron microscopy. Expression of RANKL activating molecule clastic cells was not inhibited by the drug. The OPG expression was increased in treated animals. The results demonstrate that the use of alendronate in the orthodontic movement does not interfere with osteoclast recruitment, it apparently inhibits their activation, which can interfere in the bone remodeling process and may reduce the amount of tooth movement.
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Estudo do efeito de bisfosfonatos nas células clásticas durante a ossificação endocondral do joelho de ratos e em cultura primária: abordagens morfológicas e moleculares. / Study of bisphosphonate effects on clastic cells during endochondral ossification in the rat knee and in primary cultures: morphological and molecular approaches.Eloiza de Rezende 06 December 2013 (has links)
Na ossificação endocondral, osteoclastos (Oc) reabsorvem os remanescentes de cartilagem, e osteoblastos (Ob) depositam matriz óssea. Bisfosfonatos (Bps) inibem a ação dos Oc. Foi avaliado o efeito dos Bps alendronato (Aln) e etidronato (Etn) em joelhos de ratos jovens (in vivo) e na cultura primária de Oc (in vitro). O material in vivo foi analisado por MEV, MET e ML (morfologia e histoquímica para TRAP). RNA foi extraído para análise por RT-PRC e proteínas para análise por WB, que também foram extraídos após o tratamento da cultura com Bps. O tratamento com Etn revelou lâmina epifiseal desorganizada com extensa área de cartilagem; a MEV mostrou pouco osso trabecular com lacunas de reabsorção, que não foram observadas com Aln. O Aln revelou numerosos Oc TRAP-positivos latentes, confirmados por MET. In vivo os Bps diminuem a expressão dos genes analisados; In vitro o Aln diminui somente a expressão de Runx2, menos expresso com Etn, assim como Spp1. A expressão proteica variou entre os grupos. Aln é o mais potente em inibir os Oc enquanto o Etn atua sobre os Ob. / In endochondral ossification, clastic cells (Oc) resorb the calcified cartilage, while osteoblasts (Ob) form new bone. Bisphosphonates (Bps) inhibit the action of Oc. The effect of the Bps alendronate (Aln) and etidronate (Etn) on the knees of young rats (in vivo) and in primary cultures of Oc (in vitro) was evaluated. The specimens were analyzed by SEM, TEM, and LM or TRAP histochemistry. RNA was extracted to analysis by RT-PRC and protein to analysis by WB. RNA and protein were also extracted after the treatment of cultures with Bps. Rats treated with Etn exhibited a disorganized epiphyseal plate containing large area of cartilage; SEM showed few bone trabeculae with resorption lacunae, which were not observed in Aln specimens. Aln showed numerous latent Oc by TRAP histochemistry and TEM. In vivo, the Bps decreased the expression of all analyzed genes; in vitro, Aln decreased only the expression of Runx2 as well as SPP1, which expression was less with Etn. Protein expression varied among the groups. Aln is more potent for inhibiting the Oc, while Etn acts on Ob.
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Estudo da osteoclastogênese e da remodelação óssea durante a formação e erupção de molares de ratos tratados com bisfosfonatos. / Study of the osteoclastogenesis and bone remodeling during the formation and eruption of molars of bisphosphonate-treated rats.Corrêa, Vivian Bradaschia 08 December 2011 (has links)
A erupção dentária depende de uma coordenada interação entre o germe dentário e o tecido ósseo da cripta que o envolve. Para que seja formada a via eruptiva, a reabsorção da porção oclusal da cripta óssea por osteoclastos é indispensável. Os bisfosfonatos são drogas com reconhecida capacidade de inibir a atividade clástica e foram empregados no presente estudo a fim de interferir no tecido ósseo da cripta alveolar durante a formação e erupção de molares de ratos. Doses diárias dos bisfosfonatos alendronato ou etidronato de 2,5 e 8 mg/kg, respectivamente, foram administradas a ratos recém nascidos. Os controles foram injetados com solução salina. Nos períodos de 4, 8, 14, 21 e 28 dias, as maxilas foram fixadas em 2,5% de formaldeído + 2% de glutaraldeído, 4% de formaldeído + 0,1% de glutaraldeído ou fixador Zamboni, descalcificadas em EDTA a 4,13% e processadas para análise em microscopias de luz, eletrônica de transmissão e confocal, histoquímica TRAP, imunocitoquímica para OPN, BSP, RANK, RANKL e OPG. Alguns espécimes não foram descalcificados para análise em microscopia eletrônica de varredura, ou congelados em nitrogênio líquido para extração e análise e da expressão de proteínas por Western Blotting. O etidronato ocasionou alterações no metabolismo ósseo da cripta que resultaram no atraso da erupção e da formação radicular em relação ao controle. O alendronato aumentou o número de osteoclastos no osso alveolar, porém a maioria apresentou estado latente, o que diminuiu a reabsorção óssea da cripta ao redor do germe dentário e impediu a erupção dos molares e a formação radicular. A expressão de RANKL, molécula ativadora dos osteoclastos, durante o início do processo eruptivo, diminuiu em comparação ao controle. Com a diminuição da remodelação óssea, o tecido apresentou distribuição de OPN e BSP típica de osso primário. Os resultados demonstram que a reabsorção óssea é importante em todos os pontos da cripta e não apenas em sua porção oclusal durante a formação da via eruptiva, para que a formação e erupção dentária ocorram adequadamente. / Tooth eruption depends on coordinated interactions between the tooth germ and the surrounding bony crypt. The formation of the eruptive pathway requires the resorption of the occlusal portion of the bony crypt by osteoclasts. The bisphosphonates are drugs with known capability to inhibit clastic activity, and were employed in the present study with the aim of interfering in the alveolar bony crypt during the formation and eruption of rat molars. Daily alendronate or etidronate 2.5 and 8 mg/kg doses, respectively, were administered to newborn rats. The controls were injected with saline solution. At 4, 8, 14, 21 and 28 days, the maxillae were fixed in 2.5% formaldehyde + 2% glutaraldehyde, 4% formaldehyde + 0,1% glutaraldehyde or Zambonis fixative, decalcified in 4.13% EDTA and processed for light, confocal and transmission electron microscopy analyzes, TRAP histochemistry, and immunocytochemistry for OPN, BSP, RANK, RANKL and OPG. Some specimens were left undecalcified for scanning electron microscopy analyzes, or frozen in liquid nitrogen for protein extraction and Western Blotting protein expression analyzes. Etidronate occasioned alterations in the alveolar bony crypt metabolism that resulted in the delay of tooth eruption. Alendronate increased osteoclast number in the alveolar bone; however, most of them were latent, which decreased the resorption of the bony crypt surrounding the tooth germ and impeded the eruption and root formation of the molars. The expression of RANKL, an osteoclast-activating molecule, was decreased. The inhibition of the bone remodeling resulted in typical primary bone OPN and BSP labeling pattern. These results demonstrate that bone resorption at the entire surface of the crypt, and not only during the eruptive pathway formation, is crucial for adequate tooth eruption and formation.
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Estudo do papel do eixo IL-33/ST2 na progressão da lesão periapical experimental / Study of the role of the IL-33/ST2 axis in experimental periapical lesion induced in miceLetícia Andreotti Bignardi 11 July 2014 (has links)
A citocina IL-33 apresenta papel dual e está envolvida com a resolução ou progressão de inúmeras doenças, além disso, acredita-se que a via IL-33/ST2 esteja envolvida no equilíbrio entre a atividade de osteoclastos e osteoblastos. O objetivo deste estudo foi avaliar o papel do receptor ST2 no desenvolvimento e progressão de lesões periapicais experimentalmente induzidas em camundongos. Lesões periapicais foram induzidas em primeiros molares inferiores de camundongos WT e ST2 knockout (KO). Decorridos 7 e 14 dias, as amostras de mandíbula foram submetidas às análises: determinação da área de lesão periapical em cortes histológicos e do volume por microtomografia computadorizada (μCT); contagem de osteoclastos submetidos ao ensaio de histoenzimologia (TRAP); expressão gênica de marcadores osteogênicos e osteoclastogênicos por q-PCR; quantificação de neutrófilos por ensaio de mieloperoxidases. Os linfonodos foram submetidos à análise da expressão dos fatores transcricionais T-bet, GATA-3, RORc e Foxp-3 por q-PCR. Análise estatística utilizada foi One-way ANOVA, seguido de pós-teste de Bonferroni. Aos 14 dias, observou-se maior extensão da lesão periapical em animais WT que em ST2KO (p<0,05). O tamanho da lesão nos animais ST2KO permaneceu igual em função do tempo. Foi observada maior quantidade de neutrófilos na lesão do grupo WT aos 7 dias, em comparação aos animais ST2KO (p<0,05). Na expressão de T-bet, GATA-3, RORc e Foxp-3 não foram observadas diferenças estatisticamente significantes. O número de osteoclastos contados nos animais ST2KO foi maior que o observado em WT aos 7dias e aos 14 dias (p<0,05). A expressão de Runx2 foi maior no grupo lesão dos animais ST2KO quando comparado a seu respectivo controle. Os outros marcadores relacionados com a formação óssea não apresentaram diferenças estatisticamente significantes. Dentre os marcadores relacionados com a reabsorção óssea, a catepsina K e o MMP-9 apresentaram maior expressão aos 14 dias, na lesão dos animais WT quando comparada à expressão na lesão dos animais ST2KO (p<0,05). Com base nos resultados obtidos no presente estudo, pode-se concluir que na ausência do receptor ST2 as lesões periapicais são menos extensas e embora em maior quantidade, os osteoclastos são menos ativos. Nossos resultados sugerem um importante papel da via IL-33/ST2 na ativação dos osteoclastos e desenvolvimento da lesão periapical. / The IL -33 cytokine presents a dual role and is involved either in the resolution and progression of many diseases. Furthermore, it is believed that this pathway is involved between osteoclast and osteoblast activity balance. The aim of this study was to evaluate the role of ST2 receptor in the development and progression of experimentally induced periapical lesions in mice. Periapical lesions were induced in first molars of WT and ST2 knockout (KO) mice. After 7 and 14 days, jaw samples were subjected to various analysis: determination of periapical lesions area by histology and volume by computed microtomography (μCT); osteoclasts number by TRAP histoenzymology; osteogenic and osteoclastogenic markers expression by q-PCR; neutrophil quantification by myeloperoxidase activity. The expression of transcription factors T-bet, GATA-3, RORC and Foxp-3 in lymph nodes were analysed by q-PCR. Statistical analysis was done by One-way ANOVA and Bonferroni post-test. It was observed a greater extent in periapical lesions of WT compared to ST2KO animals at 14 days (p<0.05). There is no progression in the lesion of ST2KO mice with the time. A larger number of neutrophils in WT group was observed, compared to ST2KO mice evaluated at 7 days (p<0.05). The expression of T-bet, GATA-3, RORc and Foxp-3 were not statistically significant different among the groups. The number of osteoclasts in lesions of ST2KO animals were greater than the observed in WT, at 7 and 14 days (p<0.05). Although, other osteogenic markers showed no statistically significant difference, Runx2 expression in ST2KO was higher in lesion side compared to control side at 14 days. The markers related to bone resorption, cathepsin K and MMP-9, were significantly abrogated in the lesion side of ST2KO mice, at 14 days (p<0.05). Based on the results, it can be concluded that although larger amounts of osteoclast were counted in ST2KO, the lesion was less extensive and osteoclasts less active. It all suggests that the IL-33/ST2 pathway play an important role in osteoclasts activation and periapical lesion development.
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