Ο α2 –αδρενεργικός υποδοχέας διακρίνεται σε 3 γνωστούς υποτύπους (α2Α, α2Β, α2C) και μετά αλληλεπίδραση με G-πρωτεΐνες (GPCRs), διαμεσολαβεί μέρος των δράσεων των ορμονών- νευρομεταβιβαστών, επινεφρίνη και νορεπινεφρίνη σε πολλά όργανα, συμπεριλαμβανομένου και του νευρικού συστήματος. Πρότυπο μελέτης του νευρικού συστήματος in vitro, αποτελεί η κυτταρική σειρά PC12, που περιλαμβάνει κύτταρα από φαιοχρωμοκύττωμα αρουραίου, τα οποία υπό την επίδραση του Nerve Growth Factor (NGF) διαφοροποιούνται σε συμπαθητικούς νευρώνες. Μετά από διαμόλυνση, αυτά τα κύτταρα εκφράζουν τους υποτύπους των α2-αδρενεργικών υποδοχέων και βάσει δεδομένων από προηγούμενη εμπειρία του εργαστηρίου μας, μπορούν μετά από ενεργοποίηση με επινεφρίνη να οδηγήσουν στην ενεργοποίηση ενός καταρράκτη μεταγωγής σήματος, που περιλαμβάνει τις κινάσες Akt και ERK1/2.
Δεδομένου ότι τα μόρια αυτά συμβάλλουν στην ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα CREB (cAMP response element binding protein) θελήσαμε στην παρούσα εργασία να διερευνήσουμε κατά πόσο η ενεργοποίηση των α2-αδρενεργικών υποδοχέων προκαλεί την CREB φωσφορυλίωση. Βάσει προηγούμενων αποτελεσμάτων, που αποδείκνυαν την απελευθέρωση αραχιδονικού οξέος και διαφόρων μεταβολιτών του μετά από ενεργοποίηση των α2 –αδρενεργικών υποτύπων, μελετήσαμε εάν αυτή η απελευθέρωση αραχιδονικού οξέος, μπορούσε να προκαλέσει ενεργοποίηση μέσω φωσφορυλίωσης του CREB και μέσω ποιών μεταβολικών μονοπατιών μπορεί αυτό να πραγματοποιηθεί. Επιπλέον μελετήσαμε εάν αυτή η ενεργοποίηση του CREB ήταν παρούσα και στους 3 υποτύπους και εάν παρουσίαζε υποτυποειδικότητα. Χρησιμοποιήσαμε την τεχνική Western Blotting , σε εκχυλίσματα PC12 κυττάρων, κατάλληλα επεξεργασμένων με επινεφρίνη, παρουσία διαφόρων αναστολέων των μεταβολικών μονοπατιών του αραχιδονικού οξέος.
Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η επινεφρίνη επάγει τη φωσφορυλίωση του CREB και στους 3 υποτύπους των α2-αδρενεργικών υποδοχέων σε PC12 κύτταρα. Επίσης η απελευθέρωση αραχιδονικού οξέος και η επακόλουθη φωσφορυλίωση του CREB διαμεσολαβείται από την PLC (φωσφολιπάση C) και την εποξυγενάση του κυτοχρώματος P450, αφού έχουμε αναστολή από τους ειδικούς αναστολείς U73122 και κετοκοναζόλη αντίστοιχα. Τα επίπεδα φωσφορυλίωσης ήταν ίδια στους α2A- και α2C-υποτύπους και σημαντικά μεγαλύτερα από τον α2Β-υπότυπο, αποδεικνύοντας ότι παρουσιάζεται σημαντική υποτυποειδικότητα. / α2-adrenergic receptor is divided into 3 known subtypes (α2A, α2Β, α2C) and after interaction with G-proteins (GPCRs) mediates part of actions of hormones-neurotransmitters, epinephrine and nor epinephrine in many organs, including Central Nervous System. Cell line PC12, which origins from cells of rats’ pheochromocytoma , consist a study model of nervous system in vitro and under the influence of Nerve Growth Factor (NGF) is differentiated into sympathetic neurons. After transfection, these cells express the subtypes of α2-adrenergic receptors and based on data from previous experience, after activation with epinephrine, they activate a cascade of signal transduction , which includes kinases Akt and ERK1/2.
Based on the fact that these molecules contribute to the activation of transcription factor CREB (cAMP response element binding protein) we study whether the activation of α2-adrenergic receptors can cause direct CREB phosphorylation. Based on previous results, which prove release of arachidonic acid and its metabolites after activation of α2-adrenergic subtypes, we study if the release of arachidonic acid could cause activation, through phosphorylation, of CREB and via which metabolic pathways this happens. Furthermore, we studied if the activation was present in all 3 subtypes and if it presented sub-specificity. We performed the Western Blotting technique in PC12 cells properly pro-incubated with epinephrine and addition of enzymic inhibitors of arachidonic acid metabolism.
Our results figure that epinephrine induce CREB phosphorylation in all 3 subtypes of α2-adrenergic receptors in PC12 cells. The release of arachidonic acid and the following phosphorylation of CREB is mediated from phospholipase C (PLC) and cytochrome P450-dependent epoxygenase, as proved by inhibition with the specific inhibitors U73122 and ketokonazole, respectively. The levels of CREB phosphorylation were comparable between α2Α - and α2C- subtypes and higher than the α2Β- subtype, proving that this is an action which presents sub-specificity.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/1171 |
| Date | 15 December 2008 |
| Creators | Μονάντερα, Γεωργία Σ. |
| Contributors | Φλωρδέλλης, Χριστόδουλος, Φλωρδέλλης, Χριστόδουλος, Φίλος, Κρίτων, Ταραβήρας, Σταύρος |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
| Relation | Η ΒΥΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0082 seconds