La respuesta de adaptación de la levadura Saccharomyces cerevisiae a la alcalinización ambiental provoca una remodelación de su expresión génica. Una diana clave es el gen ENA1 que codifica una ATPasa de sodio, y cuya inducción por pH alcalino está mediada por las vías de calcineurina y el Rim101.En un estudio previo se identificaron dos regiones del promotor de ENA1 responsables de su respuesta al álcali, la ARR1 (Alkaline Responsive Region 1) que es calcineurina-dependiente y ARR2 que es calcineurina-independiente. En este trabajo restringimos la región responsable de la respuesta alcalina de ARR2 a un pequeño fragmento de 42 nucleótidos que denominamos MCIR (por Minimum Calcineurin Independent Response). MCIR contiene un elemento MIG, capaz de unir a los represores Mig1 y Mig2. Observamos que la respuesta a pH alcalino de la MCIR se anula en células que carecen de Snf1, la quinasa que regula la actividad represora de Mig1 en función de la disponibilidad de glucosa. En cambio, su respuesta se ve moderadamente reducida en cepas rim101, mientras que el doble mutante mig1 mig2 presenta altos niveles de expresión a pH alcalino. Además, la deleción de NRG1 resulta en una expresión elevada y la inducción de MCIR es marginal en el cuádruple mutante nrg1,2 mig1,2. También demostramos que Nrg1 se une al extremo 5' de la ARR2 in vitro e in vivo. Por lo tanto, la respuesta de ENA1 que es calcineurina independiente esta regulada por Rim101 (a través de Nrg1) y por Snf1 (a través de Nrg1 y Mig2). De esta manera, la inducción del promotor de ENA1 por pH alcalino en un mutante rim101snf1 en presencia del inhibidor químico de la calcineurina FK506 se anula totalmente. Por lo tanto, la respuesta transcripcional de ENA1 a estrés alcalino, integra tres vías de señalización, cuya importancia relativa es Snf1 > calcineurina > Rim101.La CK2 es una quinasa que está conservada en eucariotas y participa en diversos procesos celulares. En S. cerevisiae cepas que carecen de las subunidades reguladoras Ckb1 y/o Ckb2 de la CK2 son muy sensibles a cationes de litio y de sodio. En este estudio confirmamos observaciones anteriores que describían que la respuesta de ENA1 a estrés salino y alcalino está disminuida en células que carecen de Ckb1 y/o Ckb2. Además demostramos que los mutantes ckb son sensibles a pH alcalino. Las tres vías de señalización (Rim101, calcineurina, Snf1) responsables de la regulación de ENA1 en condiciones de estrés alcalino se examinaron para posibles interacciones con la CK2. Nuestros resultados sugieren que CK2 y calcineurina regulan la expresión de ENA1 de manera independiente. Además, mostramos que la deleción de RIM101 resulta en inducción de la expresión de ENA1, disminuida en condiciones de estrés salino, y que la deleción simultanea de CKB agrava solo ligeramente el defecto de las cepas rim101 en la expresión salina y alcalina de ENA1. Deleción del factor de transcripción Nrg1 en un fondo genético ckb resulta en niveles de expresión de ENA1 relativamente altos en condiciones de estrés salino y alcalino. Estos resultados, junto con datos anteriores que muestran que Nrg1 se fosforila por CK2 en estas condiciones de estrés, son compatibles con una supuesta interacción entre CK2 y la vía Rim101. Cabe destacar que la deleción de CKB repara el defecto que presentan las células snf1 en la expresión de ENA1 bajo estrés salino y alcalino y que los mutantes ckb1,2 snf1 presentan un crecimiento en litio mayor que la cepa salvaje, sugiriendo la existencia de una interacción compleja entre CK2 y Snf1. / The adaptive response of the yeast Saccharomyces cerevisiae to environmental alkalinization results in remodeling of gene expression. A key target is the gene ENA1, encoding a sodium ATPase, whose induction by alkaline pH was shown to integrate at least two different signals, mediated by the calcineurin and the Rim101 pathways.Early work in our laboratory identified two regions in the ENA1 promoter required for full response to alkalinization, the ARR1 (from Alkaline Responsive Region 1), whose response is calcineurin-dependent and ARR2, whose response is calcineurin-independent. In this work we have restricted the alkaline response of ARR2 to a smaller fragment of 42 nucleotides that we denominated MCIR (from Minimum Calcineurin Independent Response). MCIR contains a MIG element, able to bind Mig1 and Mig2 repressors. We observe that high pH-induced response driven from MCIR is largely abolished in cells lacking Snf1, the protein kinase that regulates repressor activity of Mig1 with respect to glucose availability, and results moderately reduced in a rim101 strain, whereas the double mig1 mig2 mutant presents high levels of expression upon alkaline stress. In addition, deletion of NRG1 results in increased expression and induction from the MCIR region is marginal in a quadruple nrg1,2 mig1,2 mutant. We also demonstrate that Nrg1 binds to the 5´-end of the ARR2 region in vitro and in vivo. Therefore, the calcineurin-independent response of the ENA1 gene is under the regulation of Rim101 (through Nrg1) and Snf1 (through Nrg1 and Mig2). Accordingly, induction by alkaline stress of the entire ENA1 promoter in a snf1 rim101 mutant in the presence of the calcineurin inhibitor FK506 is completely abolished. Thus, the transcriptional response to alkaline stress of the ENA1 gene integrates three different signaling pathways, whose relative potency is Snf1 > calcineurin > Rim101. CK2 is a well conserved kinase among eukaryotes that participates in many different cellular processes. In Saccharomyces cerevisiae, strains lacking the regulatory subunits Ckb1 and/or Ckb2 of this kinase are hypersensitive to sodium and lithium cations. However, the mechanism by which CK2 affects yeast salt tolerance is not known. In this study we confirm previous observations that the alkaline and saline response of ENA1 is decreased in strains lacking Ckb1 and/or Ckb2. Furthermore, we show that ckb mutants are sensible at alkaline pH. The three pathways (Rim101, calcineurin and Snf1) responsible for ENA1 regulation under alkaline stress conditions were examined for any possible interaction with CK2. Our results suggest that CK2 and calcineurin regulate ENA1 expression under alkaline and lithium stress in an independent fashion. Moreover, we show that deletion of RIM101 results in decreased ENA1 induction under lithium stress conditions and that simultaneous mutation of CKB only slightly aggravates the defect that presents the rim101 strain in ENA1 alkaline and saline expression. Mutation of the Nrg1 transcription factor in a ckb background leads to relatively high levels of ENA1 expression under alkaline and lithium stress conditions. These results, together with previous data showing that Nrg1 is phosphorylated by CK2 under these stress conditions, support a possible interaction between the CK2 and the Rim101 pathways. Remarkably, deletion of CKB partially counteracts the defect that snf1 mutants present in ENA1 saline and alkaline expression, and ckb1,2 snf1 mutants are as tolerant as wild type cells to lithium ions, revealing a complex interaction between CK2 and Snf1.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UAB/oai:www.tdx.cat:10803/3586 |
| Date | 16 June 2008 |
| Creators | Platara, Maria |
| Contributors | Ariño Carmona, Joaquín, Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular |
| Publisher | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Source Sets | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Language | English |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
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