Zusammenfassung
Einleitung: Eimeria tenella ist ein obligat intrazellulärer Parasit und Erreger der Blinddarmkokzidiose beim Huhn. Aufgrund des verbreiteten Einsatzes von Antikokzidia sind seit langem Resistenzentwicklungen bekannt. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind komplex und nicht genau bekannt. Für den Nachweis von Resistenz gilt der Tierversuch als „Goldstandard“, er ist aber aufwändig, zeitraubend und ethisch problematisch.
Ziele der Arbeit: Es sollte ein für die Erstellung von Sensitivitätsprofilen und Wirksamkeitsprüfungen geeignetes In-vitro-Modell für E. tenella entwickelt und validiert werden. Weiterhin sollte auf mit Antikokzidiaresistenz assoziierte Änderungen im Proteom von Kokzidien untersucht werden.
Material, und Methoden: Monolayer von MDBK (Madin-Darby bovine kidney cells) dienten zur Kultivierung von E. tenella für den in vitro ASA (anticoccidial sensitivity assay). Als Parameter wurden die Inhibition (%ISIA, %IRIA) der Invasion durch Sporozoiten (SIA = sporozoite invasion inhibition assay) und der Erregerreproduktion (RIA = reproduction inhibition assay) mittels quantitativer PCR (qPCR) für E. tenella beurteilt. Die minimale Hemmkonzentration (MIC = minimal inhibitory concentration) wurde anhand einer Referenz (sensitiver Laborstamm Houghton, Ref-1) für Monensin (Mon), Salinomycin (Sal), Maduramicin (Mad), Lasalocid (Las) und Toltrazuril (Tol) bestimmt. Auf dieser Basis wurden ein zweiter Laborstamm (Wisconsin, Ref-2) und vier Feldstämme (T-376, FS-1, FS-2 und FS-3) im SIA und RIA getestet. 1.0 × 105 (SIA) und 5.0 × 104 (RIA) Sporozoiten/Well wurden verwendet. Die in vitro Ergebnisse wurden mit den in vivo Daten verglichen. Alle in vitro Versuche wurden in vier Replikaten durchgeführt. Insgesamt wurden 420 Hühner (1. Lebenstag: LT, Cobb-500) in fünf Tierversuche verwendet, um die Empfindlichkeit der E. tenella-Stämme gegen verschiedene Antikokzidia zu untersuchen. In jedem Tierversuch wurden 84 Tiere (12. LT) in 7 Gruppe (n = 12) eingeteilt. Hühner wurden mit 7,5 × 104 Oozysten je Tier am 14. LT infiziert. Die Wirksamkeitsprüfung für den alternativen Naturstoff Allicin erfolgte mittels RIA am Stamm Ref-1. Kontinuierlich in vitro als Tachyzoiten kultivierte T. gondii des RH-Stammes (Sen-RH) wurden unter ansteigenden Mon-Dosen in HFF-Zellen (human foreskin fibroblasts) über 8 Monate auf Resistenz (MonR-RH) selektiert. Es erfolgte eine stabile Isotopenmarkierung (SILAC). Für E. tenella wurden die sensitivenReferenzstämme ebenso wie die Feldstämme variabler Sensitivität isoabarisch-chemisch markiert (Tandem-Massenmarkierung, TMT). Die quantitativen Proteomanalysen erfolgten mit dem nanoUPLC-MS/MS.
Ergebnisse: Für Ref-1 betrugen die MIC95 (MIC für eine 95%ige Inhibition) 0,25 (Mon), 0,5 (Sal), 1,0 (Mad), 0,5 (Las) und 5,0 (Tol) μg/ml. Die in vitro Sensitivitätsprofile für Ref-2, FS-1, FS-2, und FS-3 stimmten für die Ionophoren mit den Ergebnissen des Tierversuchs gut überein, für Tol war das aber nicht der Fall. Signifikante Korrelationen wurden für die %IRIA-Werte mit dem Oozystenindex (OI, r = 0,290-0,507; p < 0,05), dem lesion score (LS, r = 0,279-0,345; p < 0.05, für Ref-1, Ref-2 und FS-1) und der Gewichtszunahme im Tierversuch (WGNNC, r = 0.284-0.419; p < 0.05, für Ref-1 und FS-1) festgestellt. Allicin in einer Konzentration von 1,8 mg/ml ergab einen %IRIA von 99,0%, was einer guten Wirkung entspricht. Mittels SILAC wurden 1820 Proteine identifiziert, von denen 1024 Proteine in mehr als vier biologischen Replikaten quantifizierbar waren. Bei 52 Proteinen wurden signifikante Unterschiede zwischen Sen-RH und MonR-RH festgestellt (p < 0,05). Actin, beta-Tubulin cofactor D, Perforin-like Protein 1 (PLP1), und kleine GTPase-vermittelte Signaltransduktionsproteine (GTPases) wurden in T. gondii MonR-RH hochreguliert (p < 0,05). Insgesamt waren 42 Proteine bei der resistenten Mutante MonR-RH hochreguliert. Für E. tenella wurden 97 Proteine identifiziert und 25 Proteine wurden in allen drei biologischen Replikaten quantifiziert. Mon-resistente E. tenella zeigten signifikant hochreguliertes Actin (p < 0,05). Mikronemenproteine wurden in resistenten Toxoplasma (MIC8) und Eimeria (MIC4) herunter reguliert.
Schlussfolgerungen: Das entwickelte In-vitro-Verfahren in Kombination mit der qPCR eignet sich zur Bewertung der Sensitivität von E. tenella gegenüber ionophoren Antikokzidia und erbringt Ergebnisse, die mit dem Tierversuch korrelieren. Das Modell kann Tierversuche zum Screening von Wirkstoffen reduzieren, aber nicht vollständig ersetzen, vor allem, wenn die Wirkung (auch) späte Entwicklungsstadien im Zyklus von E. tenella betrifft. Letzteres könnte die mangelnde Aussagekraft für Tol erklären. In T. gondii lässt sich Resistenz in vitro induzieren. Die Proteom-Analyse zeigte eine Verminderung der Invasion (↑ Actin, ↓ MIC8) und des Austritts (↓ PLP1), und eine Aktivierung der Replikation (↑ Actin, ↑ beta-Tubulin cofactor D, und ↑ GTPases proteine). Mon führt zu einer Erhöhung des intrazellulären Na+ gefolgt von einer Erhöhung der Ca++ Konzentrationen. Die Reduzierung der Expression von Proteinen in MonR-RH, die mit Invasion- und Austrittsaktivitäten zusammenhängen, zeigt an, dass dieser Stamm höhere Konzentrationen von Mon verträgt, indem er die ktitische Schwelle der zytosolischen Ca++ Konzentration erhöht ist, die erforderlich ist, um diese Prozesse zu provozieren.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:15753 |
| Date | 19 June 2017 |
| Creators | Thabet, Ahmed |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | English |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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