Οι COUP-TFs είναι πυρηνικοί μεταγραφικοί παράγοντες, οι οποίοι υπάγονται στην υπεροικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων. Τα μέλη της οικογένειας COUP-TF γενικά θεωρούνται καταστολείς της μεταγραφής και πολυάριθμοι μηχανισμοί έχουν προταθεί να υποστηρίζουν αυτή τους τη δράση. Με σκοπό να αποσαφηνιστεί ο μηχανισμός καταστολής των μελών της οικογένειας των COUP-TFs, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος yeast two-hybrid για να αναγνωριστούν πρωτεΐνες που εκφράζονται επίσης στον εγκέφαλο και ταυτόχρονα αλληλεπιδρούν άμεσα με μέλη της συγκεκριμένης οικογένειας. Η πρωτεΐνη CTIP1, ένα μέλος της καινούργιας οικογένειας των C2H2 πρωτεϊνών δακτύλου ψευδαργύρου, που απομονώθηκε σαν μία πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά άμεσα με τον ARP1 και πιθανόν να εμπλέκεται στη μεταγραφική καταστολή που διαμεσολαβείται από τον ARP1, η οποία είναι ανεξάρτητη από την ευαίσθητη στην τριχοστατίνη Α αποακετυλίωση των ιστονών. Τόσο η CTIP1 όσο και η CTIP2 εκφράζονται σε μεγάλο βαθμό στον εγκέφαλο μια περιοχή για την οποία είναι γνωστό ότι εκφράζονται τα μέλη της οικογένειας των COUP-TFs, υπονοώντας ότι αυτή η καινούρια οικογένεια των πρωτεϊνών C2H2 δακτύλου ψευδαργύρου πιθανόν να εμπλέκεται στο σηματοδοτικό μονοπάτι των COUP-TFs. Στο πρώτο μέρος της παρούσας μεταπτυχιακής διατριβής, ο στόχος μας ήταν να διερευνήσουμε το πρότυπο έκφρασης της πρωτεΐνης COUP-TF Interactive Protein (CTIP) στα πρώιμα αναπτυξιακά στάδια του αχινού Paracentrotus lividus με τη μέθοδο του ανοσοφθoρισμού και να συγκρίνουμε το πρότυπο αυτό με το πρότυπο έκφρασης του COUP-TF και ταυτόχρονα να ελέγξουμε αν οι δύο αυτοί μεταγραφικοί παράγοντες αλληλεπιδρούν μέσω πειραμάτων ανοσοκατακρήμνισης.
Ταυτόχρονα σημαντική ήταν και η προσπάθεια να μελετηθεί και η κατανομή των δύο ισομορφών του COUP-TF στα Μετάζωα. Το γονίδιο του COUP-TF αποτελείται, σε όλους τους μέχρι σήμερα μελετημένους οργανισμούς, από τρία εξώνια και δύο εσώνια που διακόπτουν την κωδική περιοχή του γονιδίου σε συντηρημένες θέσεις. Ωστόσο, έχει βρεθεί ότι ο αχινός Paracentrotus lividus διαφοροποιείται από αυτό το μοντέλο καθώς το γονίδιο αποτελείται από τέσσερα εξώνια (αδημοσίευτα αποτελέσματα του εργαστηρίου μας). Συγκεκριμένα, έχει βρεθεί ότι το επιπλέον εξώνιο βρίσκεται μεταξύ του πρώτου και του δεύτερου εξωνίου και έχει μέγεθος 63nt. Στο πρωτογενές μετάγραφο του COUP-TF συμβαίνει εναλλακτικό μάτισμα που έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή δύο m RNAs που κωδικοποιούν δύο πρωτεΐνες, οι οποίες διαφέρουν ως προς το μέγεθος λόγω της εισαγωγής 21 επιπρόσθετων αμινοξέων στην καρβόξυτελική περιοχή (CTE) της περιοχής πρόσδεσης στο DNA (DBD). Αν και πολλά δεν είναι γνωστά σχετικά με την ενδοκυτταρική τοποθέτηση κυρίως της μεγάλης ισομορφής, πειράματα EMSA ωστόσο εδειξαν οι δύο αυτές πρωτεΐνες διαφέρουν ως προς την ικανότητα πρόσδεσής τους στο DNA, με τη μεγάλη υπομονάδα του COUP να στερείται της ικανότητας να προσδένεται σε COUP στοιχείο απόκρισης. Σε μια προσπάθεια να μελετηθεί διεξοδικότερα το φαινόμενο του εναλλακτικού ματίσματος και συγκεκριμένα να διαπιστωθεί αν πρόκειται για ένα φαινόμενο συντηρημένο στα εχινοειδή, αποκλειστικό ή όχι αυτών, το συμπέρασμα που προέκυψε είναι ότι το εναλλακτικό μάτισμα είναι συντηρημένο και εμφανίζεται σταθερά στα είδη των αχινών που μελετήθηκαν (Paracentrotus lividus, Spaerechinus granularis, Strongylocentrotus purpuratus). Το εναλλακτικό μάτισμα λαμβάνει χώρα σε όλα τα στάδια από τα αγονιμοποίητα ωάρια εως τον πλουτέα και σε όλους τους ιστούς που o COUP-TF εκφράζεται (κοιλωματικά κύτταρα, μύες, έντερο). Για να μελετήσουμε την εξάπλωση του εναλλακτικού ματίσματος στα Μετάζωα, επιλέχθηκαν αντιπρόσωποι απ΄ όλες τις ομοταξίες του φύλου των Εχινόδερμων (Strongylocentrotus purpuratus, Amphiura filiformis, Patiria miniata, Marthasteria glacialis, Holothuria polii, Oxycomanthus japonicas), του φύλου των Ημιχορδωτών (Sakoglossus kowalevski), του φύλου των Χαιτόγναθων (Sagita minima), του υπόφυλου των Ουροχορδωτών (Ciona intestinalis) και του φύλου Xenoturbella (Xenoturbella bocki) για την απομόνωση ολικού RNA από καθέναν από αυτούς τους οργανισμούς. Αυτό το υλικό αποτέλεσε το υπόστρωμα για την πραγματοποίηση μιας σειράς πειραμάτων RT-PCR και Nested PCR με τη χρήση ειδικά σχεδιασμένων εκκινητών (degenerate primers). Η κλωνοποίηση των προιόντων σε κατάλληλο φορέα συνέβαλλε στην αλληλούχηση των κατάλληλων κλώνων. Παράλληλα, με το πρόγραμμα BLAST ψάξαμε για ομολογία της μικρής ισομορφής της πρωτεΐνης του COUP-TF του Paracentrotus lividus με άλλες πρωτεΐνες άλλων οργανισμών. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν τόσο μέσα από τη νουκλεοτιδική αλληλούχηση όσο και μέσω της ηλεκτρονικής διερεύνησης συνηγορούσαν υπέρ της παρουσίας του εναλλακτικού ματίσματος ως ενός φαινομένου καθολικού που αφορά ευρύτερες (αν όχι όλες) ομάδες των Μεταζώων. / --
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/5354 |
| Date | 05 July 2012 |
| Creators | Πετροπούλου, Χριστίνα |
| Contributors | Φλυτζάνης, Κωνσταντίνος, Christina, Petropoulou, Φλυτζάνης, Κωνσταντίνος, Μίντζας, Αναστάσιος, Κατσώρης, Παναγιώτης |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
| Relation | Η ΒΚΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0023 seconds