Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) ont pour caractéristiques principales l'auto-renouvellement permettant de les avoir de manière quasi-illimité ainsi qu'un potentiel de différenciation, qui en théorie, peut permettre de générer l’ensemble de cellules de l'organisme. Ces deux caractéristiques en font un outil de choix pour une utilisation en médecine régénérative, disséquer certains mécanismes du développement humain, l'étude de maladies génétiques et la recherche de nouveaux médicaments. Durant mes travaux de thèse, j'ai utilisé les hPSC afin de mettre en place un nouveau modèle d'étude de l'amyotrophie spinale infantile (SMA). La SMA est une maladie neurodégénérative due à la mort spécifique des motoneurones (MN) de la moelle épinière qui provoque une atrophie des muscles striés. La première étape a consisté à la mise en place d'un protocole de différenciation efficace en motoneurones à partir des hPSC. A l'issue d'un criblage combinatoire de morphogènes, nous avons identifié une condition permettant la production de motoneurones spinaux de façon efficace (70%) et rapide (14 jours). Des conditions de génération de motoneurones craniaux (50%), sensitifs (65%) et inter-neurones (75%) ont également été identifiées. Ce protocole de différenciation optimisé a ensuite été appliqué sur des lignées de cellules souches induites à la pluripotence (hIPS) reprogrammées à partir de fibroblastes porteurs de la mutation causale de la SMA ainsi que sur des fibroblastes contrôles. Nous avons mis en place un système d'étude des motoneurones en plaque 384 afin d'étudier le phénotype de dégénérescence spécifique des MN-SMA sur des cultures à long terme, via des approches d'analyse à haut débit. Nos travaux montrent que notre modèle de la SMA récapitule certains des phénotypes connus de la SMA et peut être utilisé pour des approches de criblage pharmacologique. En parallèle, nous avons également utilisé les caractéristiques des hPSC afin d'étudier un mécanisme intervenant dans les étapes précoces du développement embryonnaire. Nous avons travaillé en collaboration avec l'équipe du Dr. Rougeulle afin d'étudier les mécanismes de l'inactivation du chromosome X. Nous avons notamment déterminé l'implication du facteur Xact dans la mise en place des évènements menant à la ré-activation du chromosome X.En conclusion, les hPSC sont donc devenue des outils primordiaux pour la modélisation, qu'elle soit développementale ou pathologique et devraient permettre d'accélérer la compréhension des mécanismes physiologiques. / Human pluripotent stem cells (hPSCs) are characterized by self-renewal and pluripotency abilities that refer to the capacity to proliferate indefinitively without commitment in vitro and to the ability to differentiate into multiple and specialized cell lineages. hPSCs are a useful tool for regenerative medicine, pathological modelling and new therapeutic molecule identification.My thesis project mainly focused on the development of a new cellular model for the study of spinal muscular atrophy (SMA). SMA is mainly characterized by a specific loss of spinal motor-neurons (sMN) that induces a progressive muscle weakness. The initial objective has been to define a protocol allowing the differentiation of sMN starting from hPSC. Using combinatorial analysis, we identified experimental condition that induced an efficient (70%) and rapid (14 days) generation of sMN. In parallel, we setted up the condition needed for the specification of different subtype of MN, such as spinal interneurons (77%) and sensory neurons (64%) in the same timeline.Then, we used human induced pluripotent stem cells (hIPS) from skin biopsies of SMA patients and unaffected fibroblasts. Characterization of the MNs viability was performed in 384 wells plates with high throughput screening. Moreover, our new system allowed us to reproduce in well characterized human PSC-derived MNs specific phenotype described for SMA thus providing a new tool for HT pharmacological screening and drug discovery. In addition, in collaboration with Dr.Rougeulle, we used hPSC to study specific mechanism occurring during early stages of embryonic development. In particular, we characterized the implication of Xact in the reactivation of chromosome X.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2016SACLE020 |
| Date | 08 July 2016 |
| Creators | Côme, Julien |
| Contributors | Université Paris-Saclay (ComUE), Peschanski, Marc, Martinat, Cécile |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text, Image, StillImage |
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