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Previous issue date: 2011-12-08 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / O ferro é um elemento essencial para a sobrevivência dos microorganismos in vitro e in vivo,
atuando como cofator de diversas enzimas e desempenhando um papel crítico durante a
interação parasito-hospedeiro. Somente os parasitos mais virulentos são dotados de
mecanismos eficazes para adquirir ferro do hospedeiro sadio, conseguindo invadir, colonizar,
se multiplicar e estabelecer a infecção. L. (V.) braziliensis é um parasito distribuído por todo o
continente americano sendo considerado o principal agente etiológico da Leishmaniose
Tegumentar Americana (LTA). No presente estudo, o efeito do ferro sobre a proliferação, a
ultraestrutura e a expressão protéica de L. (V.) braziliensis é analisado pelo uso do quelante
2,2-dipyridyl. A curva de crescimento de L. (V.) braziliensis foi afetada tanto pela
concentração do quelante quanto pelo tempo de cultivo em meio depletado de ferro. Nos
ensaios de citotoxicidade, a relação entre a intensidade da fluorescência e a concentração do
quelante de ferro também foi dose dependente. As concentrações de 100, 140 e 180 µM de
2,2-dipyridyl afetaram significativamente a fluorescência emitida por ambos os isolados após
24 e 48 horas de incubação. Os valores da IC50 foram calculados após 24 e 48 horas e o
isolado IOC-L 2483, relacionado à forma disseminada da LTA, foi escolhido para a realização
de todos os ensaios subseqüentes. A análise ultraestrutural das formas promastigotas tratadas
com 100 µM de 2,2-dipyridyl revelou grande dano a mitocôndria que sofreu perda da matriz e
da crista e passou a apresentar estruturas membranares concêntricas em seu interior. A
depleção de ferro também induziu a ruptura do complexo de Golgi e a intensa vacuolização
citoplasmática. A análise de parasitos incubados com TMRE e PI por citometria de fluxo
demonstrou que a depleção de ferro acarreta na dissipação do potencial de membrana
mitocondrial embora não esteja associada permeabilização da membrana celular. A incubação
dos parasitos com TUNEL demonstrou que a privação de ferro não acarreta em fragmentação
do DNA nuclear. A análise dos extratos totais das formas promastigotas por eletroforese
bidimensional e espectrometria de massas revelou que as proteínas que tiveram sua expressão
aumentada ou diminuída após tratamento com o quelante estão relacionadas à manutenção da
homeostase do ferro, ao metabolismo dos ácidos nucléicos e à indução de modificações pós
traducionais. Nossos resultados demonstram que a depleção de ferro afeta a proliferação, a
ultraestrutura e a expressão protéica de L. (V.) braziliensis, induzindo à disfunção
mitocondrial e levando a morte do parasito. / Iron is an essential element for in vitro and in vivo survival of microorganisms, acting as a
cofactor of several enzymes and playing a critical role in host-parasite relationship. Only the
more virulent strains, endowed with effective mechanisms to acquire iron from healthy hosts
can invade, colonize, multiply and establish infection. Leishmania (Viannia) braziliensis is a
parasite widespread in the new world and considered to be the major etiological agent of
American Tegumentary Leishmaniasis (ATL). In the present study, the effect of iron on
growth, ultrastructure and protein expression of L. (V.) braziliensis is analyzed by use of the
chelator 2,2-dipyridyl. Growth curve of L. (V.) braziliensis was affected by both concentration
of iron chelator and time of culture in depleted medium. In citotoxicity assays, the ratio
between fluorescence intensity and concentration of iron chelator was also dose dependent.
Concentrations of 100, 140 and 180 µM of 2,2-dipyridyl significantly affected the
fluorescence emitted by both isolates after 24 and 48 hours of incubation. The IC50 values
were calculated after 24 and 48 hours and IOC-L 2483, related to the disseminated clinical
manifestation of the LTA, was chosen to perform all the subsequent assays. Ultrastructural
analysis of treated promastigotes revealed a remarkable mitochondrial swelling with loss of
cristae and matrix and presence of concentric membranar structures inside the organelle. Iron
depletion also induced Golgi disruption and intense cytoplasmic vacuolization. Fluorescence-
activated cell sorting analysis of tetramethylrhodamine stained parasites showed that 100 µM
of 2,2-dipyridyl collapsed the mitochondrial membrane potential. Incubation of parasites with
propidium iodide demonstrated that disruption of mitochondrial membrane potential was not
associated with plasma membrane permeabilization. TUNEL labelling for DNA fragments
was negative. Two dimensional electrophoresis and mass spectrometry analysis of whole
extracts from promastigotes showed that proteins involved in homeostasis of iron, metabolism
of nucleic acids and coordination of post-translational modifications suffered up- or down-
regulation after treatment with the iron chelator. Our results show that iron depletion affects
growth, ultrastructure and protein expression of L. (V.) braziliensis leading to mitochondrial
dysfunction and cell death.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/6907 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Rodrigues, Camila Mesquita |
| Contributors | Gaspar, Ana Maria Coimbra, Brandão, Adeilton Alves, Lima, Leila de Mendonça, Motta, Maria Cristina Machado, Barreto, Rubem Figueiredo Sadok Menna, Bourguignon, Saulo Cabral, Jesus, José Batista de |
| Publisher | Instituto Oswaldo Cruz |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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