Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-17T00:30:39Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Mestrado BP - Camila Mesquita Rodrigues.pdf: 2143075 bytes, checksum: ece36df5bf0e778217222b79d03c4bd8 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-17T00:30:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Mestrado BP - Camila Mesquita Rodrigues.pdf: 2143075 bytes, checksum: ece36df5bf0e778217222b79d03c4bd8 (MD5) Previous issue date: 2011-12-08 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / O ferro é um elemento essencial para a sobrevivência dos microorganismos in vitro e in vivo, atuando como cofator de diversas enzimas e desempenhando um papel crítico durante a interação parasito-hospedeiro. Somente os parasitos mais virulentos são dotados de mecanismos eficazes para adquirir ferro do hospedeiro sadio, conseguindo invadir, colonizar, se multiplicar e estabelecer a infecção. L. (V.) braziliensis é um parasito distribuído por todo o continente americano sendo considerado o principal agente etiológico da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA). No presente estudo, o efeito do ferro sobre a proliferação, a ultraestrutura e a expressão protéica de L. (V.) braziliensis é analisado pelo uso do quelante 2,2-dipyridyl. A curva de crescimento de L. (V.) braziliensis foi afetada tanto pela concentração do quelante quanto pelo tempo de cultivo em meio depletado de ferro. Nos ensaios de citotoxicidade, a relação entre a intensidade da fluorescência e a concentração do quelante de ferro também foi dose dependente. As concentrações de 100, 140 e 180 µM de 2,2-dipyridyl afetaram significativamente a fluorescência emitida por ambos os isolados após 24 e 48 horas de incubação. Os valores da IC50 foram calculados após 24 e 48 horas e o isolado IOC-L 2483, relacionado à forma disseminada da LTA, foi escolhido para a realização de todos os ensaios subseqüentes. A análise ultraestrutural das formas promastigotas tratadas com 100 µM de 2,2-dipyridyl revelou grande dano a mitocôndria que sofreu perda da matriz e da crista e passou a apresentar estruturas membranares concêntricas em seu interior. A depleção de ferro também induziu a ruptura do complexo de Golgi e a intensa vacuolização citoplasmática. A análise de parasitos incubados com TMRE e PI por citometria de fluxo demonstrou que a depleção de ferro acarreta na dissipação do potencial de membrana mitocondrial embora não esteja associada permeabilização da membrana celular. A incubação dos parasitos com TUNEL demonstrou que a privação de ferro não acarreta em fragmentação do DNA nuclear. A análise dos extratos totais das formas promastigotas por eletroforese bidimensional e espectrometria de massas revelou que as proteínas que tiveram sua expressão aumentada ou diminuída após tratamento com o quelante estão relacionadas à manutenção da homeostase do ferro, ao metabolismo dos ácidos nucléicos e à indução de modificações pós traducionais. Nossos resultados demonstram que a depleção de ferro afeta a proliferação, a ultraestrutura e a expressão protéica de L. (V.) braziliensis, induzindo à disfunção mitocondrial e levando a morte do parasito. / Iron is an essential element for in vitro and in vivo survival of microorganisms, acting as a cofactor of several enzymes and playing a critical role in host-parasite relationship. Only the more virulent strains, endowed with effective mechanisms to acquire iron from healthy hosts can invade, colonize, multiply and establish infection. Leishmania (Viannia) braziliensis is a parasite widespread in the new world and considered to be the major etiological agent of American Tegumentary Leishmaniasis (ATL). In the present study, the effect of iron on growth, ultrastructure and protein expression of L. (V.) braziliensis is analyzed by use of the chelator 2,2-dipyridyl. Growth curve of L. (V.) braziliensis was affected by both concentration of iron chelator and time of culture in depleted medium. In citotoxicity assays, the ratio between fluorescence intensity and concentration of iron chelator was also dose dependent. Concentrations of 100, 140 and 180 µM of 2,2-dipyridyl significantly affected the fluorescence emitted by both isolates after 24 and 48 hours of incubation. The IC50 values were calculated after 24 and 48 hours and IOC-L 2483, related to the disseminated clinical manifestation of the LTA, was chosen to perform all the subsequent assays. Ultrastructural analysis of treated promastigotes revealed a remarkable mitochondrial swelling with loss of cristae and matrix and presence of concentric membranar structures inside the organelle. Iron depletion also induced Golgi disruption and intense cytoplasmic vacuolization. Fluorescence- activated cell sorting analysis of tetramethylrhodamine stained parasites showed that 100 µM of 2,2-dipyridyl collapsed the mitochondrial membrane potential. Incubation of parasites with propidium iodide demonstrated that disruption of mitochondrial membrane potential was not associated with plasma membrane permeabilization. TUNEL labelling for DNA fragments was negative. Two dimensional electrophoresis and mass spectrometry analysis of whole extracts from promastigotes showed that proteins involved in homeostasis of iron, metabolism of nucleic acids and coordination of post-translational modifications suffered up- or down- regulation after treatment with the iron chelator. Our results show that iron depletion affects growth, ultrastructure and protein expression of L. (V.) braziliensis leading to mitochondrial dysfunction and cell death.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5298.pdf: 2436195 bytes, checksum: 47a2b6b8993059d60e028c4518c3ca75 (MD5) Previous issue date: 2013-05-24 / Universidade Federal de Sao Carlos / The citrus canker is an economically important disease for citrus crop. At the moment, there is no effective means of prevention or cure for this disease, which has contributed to citrus canker wide distribution around the world. The etiologic agents are bacteria of the genus Xanthomonas classified into two species, X. citri and X. fuscans. This study aimed to perform the differential proteomic analysis of cell surface proteins of Xanthomonas citri subsp. citri (XAC), the more virulent specie, between infectious (in vivo) and non-infectious (in vitro) conditions of growth. Additionally, the same analysis was performed by shotgun for XAC against the Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii type B (XauB), less virulent specie, both after growth in vivo. Initially, we performed growth curves of both bacteria on leaves of a common citrus host (Citrus aurantifolia) in order to investigate the dynamics of population growth in vivo and the efficiency of cell recovery by two different methods. For proteomic analysis, intact bacterial cells had their surface proteins labeled with fluorescence (DIGE CyDye Fluor minimal dyes), were then lysed and the total protein extract analyzed by differential gel electrophoresis (2D-DIGE), as standardized in this study. Protein profiles were analyzed by DeCyder 7.0 software and spots differentially expressed (ANOVA p <0.05) were isolated from gels, identified by mass spectrometry and search in protein databases of the annotated genome sequence of the bacteria. Seventy-nine spots from XAC were analyzed and thirty different proteins were identified, of which 10 correspond to known membrane or cell surface proteins: Ton-B dependent receptors and OmpA-related proteins exhibited lower expression in infectious condition, differently of Ferric enterobactin receptors, 60 kDa chaperonin (GroEL) and DnaK which showed higher expression after host interaction. XAC and XauB total extraction analysis by shotgun identified just two XAC proteins. Cell surface proteins with increased in vivo expression in virulent strain (XAC) could provide future targets of biotechnological interest for fighting citrus canker for being possibly related to phytopathogenicity and/or host spectrum. / O cancro cítrico é uma doença economicamente importante para a citricultura. Devido à inexistência de medidas eficazes de prevenção e combate, o cancro cítrico ainda é uma doença de ampla distribuição. Os agentes etiológicos são bactérias do gênero Xanthomonas, sendo classificadas em duas espécies, X. citri e X. fuscans, as quais diferem em virulência e espectro de hospedeiros cítricos. Este trabalho teve como objetivo a análise diferencial do subproteoma da superfície celular de Xanthomonas citri subsp. citri (XAC), espécie mais virulenta e causadora da cancrose A, entre duas condições de crescimento, infectante (in vivo) e não infectante (in vitro). Adicionalmente, a análise proteômica total por shotgun (LC-MS/MS) foi realizada para comparação de XAC com Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii tipo B (XauB), espécie menos virulenta, ambas após crescimento in vivo. Inicialmente, foram realizadas curvas de crescimento de ambas as bactérias em folhas de um hospedeiro cítrico comum (Citrus aurantifolia) a fim de se conhecer a dinâmica de crescimento populacional in vivo e a eficiência da recuperação bacteriana por dois diferentes métodos. Para as análises proteômicas, células bacterianas intactas tiveram suas proteínas de superfície marcadas com fluorescência (CyDye DIGE Fluor minimal dyes) e em seguida foram lisadas, sendo o extrato proteico total analisado por eletroforese diferencial em gel bidimensional (2D-DIGE), técnica padronizada neste trabalho. Os perfis proteicos de XAC foram analisados pelo software DeCyder 7.0 (GE Healthcare) e spots com expressão diferencial (ANOVA p<0,05) foram isolados dos géis e identificados por espectrometria de massas seguida de busca pela ferramenta Mascot em bancos de proteínas anotadas a partir da sequência genômica. Dos 79 spots de XAC analisados foram identificadas 30 diferentes proteínas, sendo que 10 correspondem a proteínas reconhecidamente de membrana e/ou superfície celular: receptores dependentes de Ton-B e proteínas relacionadas a OmpA foram encontradas com menor expressão na condição in vivo, enquanto que receptor de enterobactina, chaperonina 60 kDa (GroEL) e DnaK apresentaram maior expressão após interação com hospedeiro cítrico. Em relação à comparação do extrato total de XAC e XauB por shotgun foi possível identificar apenas duas proteínas de XAC. Proteínas da superfície celular com maior expressão na linhagem virulenta (XAC) na condição in vivo poderão ser futuros alvos de interesse biotecnológico para combate ao cancro cítrico por estarem possivelmente relacionadas com a fitopatogenicidade e/ou maior espectro de hospedeiros cítricos.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4434.pdf: 2956570 bytes, checksum: f54aa91fcb424a121affb3c9674f546e (MD5) Previous issue date: 2012-08-17 / Universidade Federal de Minas Gerais / The aim of this work was to perform differential proteomic analysis of the periplasmic protein profiles of the genome strains A, B and C of Xanthomonas spp, which differ in pathogenicity and host range of citrus. The strain Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) is the most virulent and infects all types of citrus, while the strain B (Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, Xau-B) is less virulent and the strain C (Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, Xau-C) has a unique citrus-host. The comparative proteomic analysis of Xau-B and Xau-C in relation to Xac can reveal genes and proteins involved in pathogenicity and host range of citrus, respectively. The strains A (Xanthomonas citri subsp. citri, Xac) and C (Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, Xau-C) were grown in XAM-1, which is known to be a pathogenicity-inducing medium for Xac, and in a non-inducing pathogenicity (Nutrient Broth, NB). Proteins from both types (grown in triplicate using both media), were separated by bidimensional electrophoresis (2DPAGE) and the gels were stained using Coomassie Brilliant Blue R-250 and documented. A comparative analysis of the protein profiles of Xac and Xau-B, and Xac and Xau-C, grown in the same culture medium, was performed using ImageMaster Platinum software (GE Healthcare). Statistical analysis (ANOVA) revealed a large number of periplasmic proteins that presented type-specific or differential expression between the two bacteria. For the comparison between Xac and Xau-B we used the twodimensional Xau-B gels of periplasmic proteins obtained by Carnielli (2011). The differential spots between Xac and Xau-C, Xac and Xau-B that showed a significant differential expression (p <0.05) were isolated from gels and identified by ESI-QUADTOF mass spectrometry (LNBio, Campinas-SP), employing Xac, Xau-B and Xau-C databases. Several differentially expressed proteins between strains were identified for the different conditions studied, showing that some of them were strain-specific (approximately 10) while others were expressed in all strains, differing only in intensity. Those proteins potentially related to pathogenicity and citrus host were quantified using the software Scaffold v. 3.0, for the mass spectrometry data.The results showed that Xac, Xau-B, and Xau-C had remarkable differences between the periplasm protein profiles for both conditions, even under conditions of no induction of pathogenicity. The proteomics approach showed that even though the strains showed a different pattern of protein expression, the sequences of genes related to the differential proteins are present in all strains. Based on the proteomic analysis, proteins that showed remarkable differential expression between the genome strainswere selected, and its expression was evaluated by Western blot in periplasmic fraction of the bacteria. The data obtained in the the comparative proteomic analysis for the superoxide dismutase corroborated most quantitative results generated by the software Scaffold. This work showed that the proteomic analysis, combined with quantitative analysis tools, is an important tool that comes to complement genomic investigations designed to differentiate the species of Xanthomonas spp. / O presente trabalho teve por objetivo a análise proteômica comparativa da fração periplasmática das estirpes-genoma A, B e C de Xanthomonas spp, as quais diferem em patogenicidade e gama de citros hospedeiros. A estirpe A (Xanthomonas citri subsp. citri, Xac) é a mais virulenta e infecta todos os tipos de citros, enquanto que a estirpe B (Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, Xau-B) é menos virulenta e a estirpe C (Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, Xau-C) possui um único hospedeiro cítrico. Estas estirpes foram cultivadas em meio XAM-1, conhecido como sendo um meio indutor de patogenicidade para Xac, e em meio não indutor de patogenicidade (Caldo Nutriente, CN). Após a extração de proteínas da fração periplasmática em triplicata, as mesmas foram separadas por eletroforese bidimensional (2D-PAGE) e os géis foram corados com Coomassie Brilliant Blue R-250 e documentados. A análise proteômica comparativa de Xau-B e Xau-C relativamente à Xac pode nos levar a genes e proteínas envolvidas com patogenicidade e espectro de hospedeiro cítrico, respectivamente. Assim, Xac e Xau-C foram cultivadas em triplicata em meio XAM-1, conhecido como sendo um meio indutor de patogenicidade para Xac, e em meio não indutor de patogenicidade (Caldo Nutriente, CN), sendo as células coletadas ao final da fase exponencial de crescimento, segundo curvas previamente realizadas. Após a extração de proteínas periplasmáticas, as mesmas foram separadas por eletroforese bidimensional (2D-PAGE) e os géis foram corados com Coomassie Brilliant Blue R-250 e documentados. Uma análise estatística das diferenças observadas nas intensidades dos spots nos géis 2D foi realizada entre Xau-C e Xac e entre Xau-B e Xac (nos mesmos meios de cultura) utilizando o software Image Master 2D-Platinum (GE Healthcare). Para esta última comparação foram utilizados os géis bidimensionais de proteínas periplasmáticas de Xau-B obtidos por Carnielli (2011). As proteínas diferenciais entre Xac e Xau-C e entre Xac e Xau-B que apresentaram uma expressão diferencial significativa (p<0,05) foram isoladas a partir dos géis e identificadas por espectrometria de massas (LNBio, Campinas-SP) após pesquisa em banco de proteínas anotadas a partir do genoma de cada uma das linhagens. Inúmeras proteínas diferencialmente expressas entre as linhagens foram identificadas para as diferentes condições estudadas, demonstrando que algumas foram estirpe-específicas (10 aproximadamente) enquanto outras foram expressas em todas as linhagens, diferindo na sua intensidade. Aquelas proteínas que indicaram alguma potencialidade em relação à patogenicidade e hospedeiro cítrico foram quantificadas com o uso do software Scaffold v. 3,0, a partir de dados provenientes da espectrometria de massas. Os resultados obtidos demonstram que Xac, Xau-B e Xau-C apresentam perfis proteicos marcadamente diferentes na fração de periplasma, mesmo em condições de não indução da patogenicidade. A abordagem proteômica evidenciou que embora as estirpes apresentem um padrão de expressão protéica muito distinto na fração rica em proteínas periplasmáticas, as sequências dos genes relacionados às proteínas diferenciais (superóxido dismutase e fosfoglicomutase) estão presentes em todas as estirpes. Com base na análise proteômica, foram selecionadas proteínas que apresentaram expressão diferencial acentuada entre as linhagens-genomas, nas condições estudadas, sendo sua expressão avaliada por Western blot contra extrato protéico periplasmático das três linhagens- genomas, após cultivo das mesmas em meio CN e XAM-1 Os dados obtidos para a superoxido dismutase corroboraram a maioria dos resultados quantitativos gerados pelo software Scaffold. Este trabalho evidenciou que a análise proteômica, aliada às ferramentas de análises quantitativas, é um recurso que vem complementar as investigações genômicas destinadas a diferenciar as diferentes espécies de Xanthomonas spp. Sob os aspectos biotecnológicos a busca e identificação de proteínas biomarcadoras, em especial aquelas relacionadas com patogenicidade e especificidade à hospedeiro, são importantes alvos para produção de drogas no combate ao cancro cítrico.