Xanthomonas fuscans subsp. fuscans (Xff) est l'un des agents responsables de la graisse commune de haricot, bactériose transmise par les semences. A partir d'une semence contaminée, cet agent pathogène colonise les parties aériennes de son hôte sur la totalité d'un cycle cultural sans enclencher de processus infectieux ; cela aboutit finalement à sa transmission à la graine. Les objectifs de cette thèse ont été d'identifier des déterminants moléculaires de Xff et de caractériser leur rôle dans trois étapes clés de la colonisation asymptomatique du haricot. Deux types de gènes candidats ont été identifiés chez Xff : des gènes induits in planta codant le système de sécrétion de type trois (SST3) et ses effecteurs, des gènes impliqués dans les processus d'adhésion aux surfaces et de formation des biofilms.Contrairement à la phyllosphère, la graine de haricot en germination et les jeunes plantules ne constituent pas des environnements limitant pour la multiplication bactérienne. L'absence d'induction de réactions de défense à cette étape laisse penser que les bactéries se comportent en saprophytes sans dialogue moléculaire avec la plante. La survie de Xff dans la phyllosphère du haricot dépend partiellement des régulateurs HrpG et HrpX du SST3 ; la colonisation active et la transmission aux graines par la voie vasculaire nécessitent quant à elle un SST3 fonctionnel. En situation incompatible non-hôte, X. campestris pv. campestris et ses mutants du SST3 survivent et se transmettent à la graine de haricot, mais peu fréquemment et avec de faibles tailles de populations. Les six adhésines identifiées chez Xff interviennent toutes lors de la colonisation de la phyllosphère ou pour la transmission à la graine de haricot par la voie vasculaire. La transmission à la graine par la voie florale est une voie plus générale, régulée seulement partiellement par HrpG et HrpX.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4434.pdf: 2956570 bytes, checksum: f54aa91fcb424a121affb3c9674f546e (MD5) Previous issue date: 2012-08-17 / Universidade Federal de Minas Gerais / The aim of this work was to perform differential proteomic analysis of the periplasmic protein profiles of the genome strains A, B and C of Xanthomonas spp, which differ in pathogenicity and host range of citrus. The strain Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) is the most virulent and infects all types of citrus, while the strain B (Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, Xau-B) is less virulent and the strain C (Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, Xau-C) has a unique citrus-host. The comparative proteomic analysis of Xau-B and Xau-C in relation to Xac can reveal genes and proteins involved in pathogenicity and host range of citrus, respectively. The strains A (Xanthomonas citri subsp. citri, Xac) and C (Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, Xau-C) were grown in XAM-1, which is known to be a pathogenicity-inducing medium for Xac, and in a non-inducing pathogenicity (Nutrient Broth, NB). Proteins from both types (grown in triplicate using both media), were separated by bidimensional electrophoresis (2DPAGE) and the gels were stained using Coomassie Brilliant Blue R-250 and documented. A comparative analysis of the protein profiles of Xac and Xau-B, and Xac and Xau-C, grown in the same culture medium, was performed using ImageMaster Platinum software (GE Healthcare). Statistical analysis (ANOVA) revealed a large number of periplasmic proteins that presented type-specific or differential expression between the two bacteria. For the comparison between Xac and Xau-B we used the twodimensional Xau-B gels of periplasmic proteins obtained by Carnielli (2011). The differential spots between Xac and Xau-C, Xac and Xau-B that showed a significant differential expression (p <0.05) were isolated from gels and identified by ESI-QUADTOF mass spectrometry (LNBio, Campinas-SP), employing Xac, Xau-B and Xau-C databases. Several differentially expressed proteins between strains were identified for the different conditions studied, showing that some of them were strain-specific (approximately 10) while others were expressed in all strains, differing only in intensity. Those proteins potentially related to pathogenicity and citrus host were quantified using the software Scaffold v. 3.0, for the mass spectrometry data.The results showed that Xac, Xau-B, and Xau-C had remarkable differences between the periplasm protein profiles for both conditions, even under conditions of no induction of pathogenicity. The proteomics approach showed that even though the strains showed a different pattern of protein expression, the sequences of genes related to the differential proteins are present in all strains. Based on the proteomic analysis, proteins that showed remarkable differential expression between the genome strainswere selected, and its expression was evaluated by Western blot in periplasmic fraction of the bacteria. The data obtained in the the comparative proteomic analysis for the superoxide dismutase corroborated most quantitative results generated by the software Scaffold. This work showed that the proteomic analysis, combined with quantitative analysis tools, is an important tool that comes to complement genomic investigations designed to differentiate the species of Xanthomonas spp. / O presente trabalho teve por objetivo a análise proteômica comparativa da fração periplasmática das estirpes-genoma A, B e C de Xanthomonas spp, as quais diferem em patogenicidade e gama de citros hospedeiros. A estirpe A (Xanthomonas citri subsp. citri, Xac) é a mais virulenta e infecta todos os tipos de citros, enquanto que a estirpe B (Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, Xau-B) é menos virulenta e a estirpe C (Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, Xau-C) possui um único hospedeiro cítrico. Estas estirpes foram cultivadas em meio XAM-1, conhecido como sendo um meio indutor de patogenicidade para Xac, e em meio não indutor de patogenicidade (Caldo Nutriente, CN). Após a extração de proteínas da fração periplasmática em triplicata, as mesmas foram separadas por eletroforese bidimensional (2D-PAGE) e os géis foram corados com Coomassie Brilliant Blue R-250 e documentados. A análise proteômica comparativa de Xau-B e Xau-C relativamente à Xac pode nos levar a genes e proteínas envolvidas com patogenicidade e espectro de hospedeiro cítrico, respectivamente. Assim, Xac e Xau-C foram cultivadas em triplicata em meio XAM-1, conhecido como sendo um meio indutor de patogenicidade para Xac, e em meio não indutor de patogenicidade (Caldo Nutriente, CN), sendo as células coletadas ao final da fase exponencial de crescimento, segundo curvas previamente realizadas. Após a extração de proteínas periplasmáticas, as mesmas foram separadas por eletroforese bidimensional (2D-PAGE) e os géis foram corados com Coomassie Brilliant Blue R-250 e documentados. Uma análise estatística das diferenças observadas nas intensidades dos spots nos géis 2D foi realizada entre Xau-C e Xac e entre Xau-B e Xac (nos mesmos meios de cultura) utilizando o software Image Master 2D-Platinum (GE Healthcare). Para esta última comparação foram utilizados os géis bidimensionais de proteínas periplasmáticas de Xau-B obtidos por Carnielli (2011). As proteínas diferenciais entre Xac e Xau-C e entre Xac e Xau-B que apresentaram uma expressão diferencial significativa (p<0,05) foram isoladas a partir dos géis e identificadas por espectrometria de massas (LNBio, Campinas-SP) após pesquisa em banco de proteínas anotadas a partir do genoma de cada uma das linhagens. Inúmeras proteínas diferencialmente expressas entre as linhagens foram identificadas para as diferentes condições estudadas, demonstrando que algumas foram estirpe-específicas (10 aproximadamente) enquanto outras foram expressas em todas as linhagens, diferindo na sua intensidade. Aquelas proteínas que indicaram alguma potencialidade em relação à patogenicidade e hospedeiro cítrico foram quantificadas com o uso do software Scaffold v. 3,0, a partir de dados provenientes da espectrometria de massas. Os resultados obtidos demonstram que Xac, Xau-B e Xau-C apresentam perfis proteicos marcadamente diferentes na fração de periplasma, mesmo em condições de não indução da patogenicidade. A abordagem proteômica evidenciou que embora as estirpes apresentem um padrão de expressão protéica muito distinto na fração rica em proteínas periplasmáticas, as sequências dos genes relacionados às proteínas diferenciais (superóxido dismutase e fosfoglicomutase) estão presentes em todas as estirpes. Com base na análise proteômica, foram selecionadas proteínas que apresentaram expressão diferencial acentuada entre as linhagens-genomas, nas condições estudadas, sendo sua expressão avaliada por Western blot contra extrato protéico periplasmático das três linhagens- genomas, após cultivo das mesmas em meio CN e XAM-1 Os dados obtidos para a superoxido dismutase corroboraram a maioria dos resultados quantitativos gerados pelo software Scaffold. Este trabalho evidenciou que a análise proteômica, aliada às ferramentas de análises quantitativas, é um recurso que vem complementar as investigações genômicas destinadas a diferenciar as diferentes espécies de Xanthomonas spp. Sob os aspectos biotecnológicos a busca e identificação de proteínas biomarcadoras, em especial aquelas relacionadas com patogenicidade e especificidade à hospedeiro, são importantes alvos para produção de drogas no combate ao cancro cítrico.

Submitted by Franciele Moreira (francielemoreyra@gmail.com) on 2018-10-15T13:46:38Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Helton Salles da Silva - 2017.pdf: 3105351 bytes, checksum: 0468af71a8e8a4810e5e7793d972203c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-10-15T14:48:27Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Helton Salles da Silva - 2017.pdf: 3105351 bytes, checksum: 0468af71a8e8a4810e5e7793d972203c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-15T14:48:27Z (GMT). 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In this sense, the main objectives of the present study was to: (i) evaluate the genetic potential and to select superior progenies from a population of recurrent selection for resistance to CBB in common bean of the black commercial group; (ii) study the adaptability and stability of families S0:4, S0:5 and S0:6 in different environments; (iii) estimate the genetic gains obtained with the selection of the ten best families; and (iv) select families that are resistant to CBB while associated to other variables of agronomic importance such as grain yield, plant bedding and resistance to anthracnose. Sixty families of a C0 population were evaluated in the years 2015 and 2016 in different environments, in randomized blocks design with three replicates. After the evaluations, analyzes of individual and joint variance were performed, as well as the application of the ranks sum index using “Genes” software. Subsequently, analyzes of adaptability and phenotypic stability were performed in the selected families, using the methodology of Nunes et al. From the simultaneous selection for grain yield and resistance to CBB, ten families considered more promising were selected. Then, a new selection was made, including the plant bedding criteria and, lastly, the variable anthracnose resistance was included. Selection gains were obtained for all the variables. Most of the selected families presented better individual results in relation to the resistance to CBB variable. And the great majority of the selected families presented themselves adapted and stable, mainly in comparison with other bean treatments. Among the families with the best performance, the families SRCP.55 and SRCP.318 were highlighted for grain yield, resistance to CBB and anthracnose. By selecting these families, it is expected that they may be used in hybridization stages carried out in new studies, either as parents in other programs as sources of resistance to CBB, or in their use as new cultivars. / A cultura do feijoeiro-comum (Phaseolus vulgaris L.) tem grande importância na alimentação humana e seu emprego se dá nos mais variados sistemas de plantio. Logo, há a necessidade de desenvolvimento de cultivares adaptadas a esses diferentes sistemas e que atendam concomitantemente às necessidades de produtores e consumidores. Diferentes fatores têm contribuído para diminuir a produtividade da cultura, dentre estes, destaca-se o crestamento bacteriano comum (CBC) causado por Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli e Xanthomonas fuscans subsp. fuscans. Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivos: (i) avaliar o potencial genético e selecionar progênies superiores oriundas de uma população de seleção recorrente para resistência ao CBC em feijoeiro-comum do grupo comercial preto. (ii) estudar a adaptabilidade e estabilidade das famílias S0:4, S0:5 e S0:6 em diferentes ambientes; (iii) estimar ganhos genéticos obtidos com a seleção das dez melhores famílias; (iv) selecionar famílias resistentes ao CBC associadas a outras variáveis de importância agronômica como produtividade de grãos, acamamento de planta e resistência à antracnose. Foram avaliadas 60 famílias de uma população C0 nos anos de 2015 e 2016 em diferentes ambientes, no delineamento em blocos ao acaso com três repetições. Após as avaliações, foram feitas análises de variância individual e conjunta, bem como a aplicação do índice da soma de “ranks” utilizando-se o programa “Genes”. Posteriormente, as famílias selecionadas foram submetidas às análises de adaptabilidade e estabilidade fenotípica, de acordo com a metodologia de Nunes et al. Foram selecionadas, partindo-se da seleção simultânea para produtividade de grãos e resistência ao CBC, dez famílias consideradas mais promissoras. Em seguida, foi feita nova seleção, incluindo-se o acamamento de planta e sendo incluída, por fim, a variável resistência à antracnose. Obteve-se ganhos de seleção para todas as variáveis. A maior parte das famílias selecionadas apresentou melhores resultados individuais em relação à variável de resistência ao CBC. E a grande maioria das famílias selecionadas mostraram-se adaptadas e estáveis, principalmente, quando comparadas às testemunhas. Dentre as famílias de melhor desempenho, se destacaram as famílias SRCP.55 e SRCP.318 para produtividade de grãos, resistência ao CBC e antracnose. Com a seleção dessas famílias, espera-se que as mesmas possam vir a ser utilizadas em etapas de hibridizações realizadas em novos estudos, seja como genitores em outros programas como fontes de resistência ao CBC, seja também em sua utilização como novas cultivares.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5298.pdf: 2436195 bytes, checksum: 47a2b6b8993059d60e028c4518c3ca75 (MD5) Previous issue date: 2013-05-24 / Universidade Federal de Sao Carlos / The citrus canker is an economically important disease for citrus crop. At the moment, there is no effective means of prevention or cure for this disease, which has contributed to citrus canker wide distribution around the world. The etiologic agents are bacteria of the genus Xanthomonas classified into two species, X. citri and X. fuscans. This study aimed to perform the differential proteomic analysis of cell surface proteins of Xanthomonas citri subsp. citri (XAC), the more virulent specie, between infectious (in vivo) and non-infectious (in vitro) conditions of growth. Additionally, the same analysis was performed by shotgun for XAC against the Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii type B (XauB), less virulent specie, both after growth in vivo. Initially, we performed growth curves of both bacteria on leaves of a common citrus host (Citrus aurantifolia) in order to investigate the dynamics of population growth in vivo and the efficiency of cell recovery by two different methods. For proteomic analysis, intact bacterial cells had their surface proteins labeled with fluorescence (DIGE CyDye Fluor minimal dyes), were then lysed and the total protein extract analyzed by differential gel electrophoresis (2D-DIGE), as standardized in this study. Protein profiles were analyzed by DeCyder 7.0 software and spots differentially expressed (ANOVA p <0.05) were isolated from gels, identified by mass spectrometry and search in protein databases of the annotated genome sequence of the bacteria. Seventy-nine spots from XAC were analyzed and thirty different proteins were identified, of which 10 correspond to known membrane or cell surface proteins: Ton-B dependent receptors and OmpA-related proteins exhibited lower expression in infectious condition, differently of Ferric enterobactin receptors, 60 kDa chaperonin (GroEL) and DnaK which showed higher expression after host interaction. XAC and XauB total extraction analysis by shotgun identified just two XAC proteins. Cell surface proteins with increased in vivo expression in virulent strain (XAC) could provide future targets of biotechnological interest for fighting citrus canker for being possibly related to phytopathogenicity and/or host spectrum. / O cancro cítrico é uma doença economicamente importante para a citricultura. Devido à inexistência de medidas eficazes de prevenção e combate, o cancro cítrico ainda é uma doença de ampla distribuição. Os agentes etiológicos são bactérias do gênero Xanthomonas, sendo classificadas em duas espécies, X. citri e X. fuscans, as quais diferem em virulência e espectro de hospedeiros cítricos. Este trabalho teve como objetivo a análise diferencial do subproteoma da superfície celular de Xanthomonas citri subsp. citri (XAC), espécie mais virulenta e causadora da cancrose A, entre duas condições de crescimento, infectante (in vivo) e não infectante (in vitro). Adicionalmente, a análise proteômica total por shotgun (LC-MS/MS) foi realizada para comparação de XAC com Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii tipo B (XauB), espécie menos virulenta, ambas após crescimento in vivo. Inicialmente, foram realizadas curvas de crescimento de ambas as bactérias em folhas de um hospedeiro cítrico comum (Citrus aurantifolia) a fim de se conhecer a dinâmica de crescimento populacional in vivo e a eficiência da recuperação bacteriana por dois diferentes métodos. Para as análises proteômicas, células bacterianas intactas tiveram suas proteínas de superfície marcadas com fluorescência (CyDye DIGE Fluor minimal dyes) e em seguida foram lisadas, sendo o extrato proteico total analisado por eletroforese diferencial em gel bidimensional (2D-DIGE), técnica padronizada neste trabalho. Os perfis proteicos de XAC foram analisados pelo software DeCyder 7.0 (GE Healthcare) e spots com expressão diferencial (ANOVA p<0,05) foram isolados dos géis e identificados por espectrometria de massas seguida de busca pela ferramenta Mascot em bancos de proteínas anotadas a partir da sequência genômica. Dos 79 spots de XAC analisados foram identificadas 30 diferentes proteínas, sendo que 10 correspondem a proteínas reconhecidamente de membrana e/ou superfície celular: receptores dependentes de Ton-B e proteínas relacionadas a OmpA foram encontradas com menor expressão na condição in vivo, enquanto que receptor de enterobactina, chaperonina 60 kDa (GroEL) e DnaK apresentaram maior expressão após interação com hospedeiro cítrico. Em relação à comparação do extrato total de XAC e XauB por shotgun foi possível identificar apenas duas proteínas de XAC. Proteínas da superfície celular com maior expressão na linhagem virulenta (XAC) na condição in vivo poderão ser futuros alvos de interesse biotecnológico para combate ao cancro cítrico por estarem possivelmente relacionadas com a fitopatogenicidade e/ou maior espectro de hospedeiros cítricos.