Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_nubia_seyffert.pdf: 4325642 bytes, checksum: 2836f7bcdef6a962ef1e00c38936c413 (MD5) Previous issue date: 2007-02-05 / Leptospiral immunoglobulin-like (Lig)proteins are exposed on membrane surface of pathogenic Leptospira and may play a role in host cell attachment and invasion during infection.A pair of Ligs,named LigA and LigB,with identical and non-identical polypeptide regions has recently been identified.The two proteins elicit a strong humoral immune response during acute host infection and have been suggested as targets for development of vaccines and diagnostic tests for leptospirosis.This study reports the production and characterization of monoclonal antibodies (Mabs)against recombinant non-identical fragments of LigA (rLigANI)and LigB (rLigBNI).The recombinant fragments were used for mice immunization and screening hybridomas by indirect ELISA.Four Mabs obtained against rLigANI and six Mabs obtained against rLigBNI were isotyped and evaluated regarding their potential for use in studies of immunoprotection and diagnostic test development.The Mabs were of the IgM (1),Ig 2b (3)and Ig 1 (6)isotypes and reacted with the native proteins from a pathogenic strain of Leptospira i terroga s serovar Copenhageni L1 130 in an indirect ELISA and immunofluorescence.Mabs affinity constants felt between 4x10 7 M -1 and 2x10 8 M -1 ,and epitope mapping by additive ELISA has shown that each Mab either react with the same epitope in the recombinant molecule or cause steric hindrance. Tissue sections from kidneys of hamsters experimentally infected with leptospires and probed with the Mabs reacted positively by immunohistochemistry.These findings suggest that the Mabs obtained can be useful for the studies of immunoprotection and development of diagnostic tests. / As proteínas leptospiral immu oglobuli -like (Lig)estão expostas na superfície da membrana das leptospiras patogênicas e podem estar envolvidas no ataque e penetração às células do hospedeiro durante a infecção.Recentemente,foi identificado um par de Ligs,nomeadas LigA e LigB,com regiões polipeptídicas idênticas e não-idênticas.As duas proteínas estimulam uma resposta humoral forte durante a infecção aguda no hospedeiro e têm sido sugeridas como alvos para o desenvolvimento de vacinas e testes diagnósticos para leptospirose.Este estudo relata a produção e caracterização de anticorpos monoclonais (Mabs)contra fragmentos recombinantes não idênticos de LigA (rLigANI)e LigB (rLigBNI).Os fragmentos recombinantes foram utilizados para a imunização dos camundongos e triagem dos hibridomas por ELISA indireto.Quatro Mabs obtidos contra rLigANI e 6 Mabs contra rLigBNI foram isotipados e avaliados quanto ao seu potencial para uso em estudos de imunoproteção e desenvolvimento de testes diagnósticos.Os Mabs foram dos isotipos IgM (1),Ig 2b (3)and Ig 1 (6)e reagiram com as proteínas nativas de Leptospira i terroga s sorovar Copenhageni cepa L1 130 em ELISA indireto e imunofluorescência.A constante de afinidade dos Mabs manteve-se entre 4x10 7 M -1 and 2x10 8 M -1 ,e o mapeamento de epitopos por ELISA de aditividade demonstrou que cada Mab reage com o mesmo epitopo na molécula recombinante ou causa um impedimento espacial (steric hi dra ce ).Finalmente,os Mabs reagiram positivamente em testes imuno-histoquímicos de seções do tecido renal de hamsters experimentalmente infectados com leptospiras.Esses dados sugerem que os Mabs obtidos podem ser usados para estudos de imunoproteção e desenvolvimento de testes de diagnóstico de leptospirose.

Neospora caninum é um parasita intracelular obrigatório do filo Apicomplexa, intimamente relacionado a Toxoplasma gondii e responsável por abortamento e perda da fertilidade em bovinos, o que acarreta prejuízos significativos na pecuária mundial. Como parte de seu ciclo intracelular, a primeira interação do parasita com a célula alvo é realizada por proteínas de superfície conhecidas como superfamília SRS (Surface Antigen Glycoprotein - Related Sequences). Proteínas SRS ou SAG tem sido alvo de intensas pesquisas devido ao seu padrão imunodominante, exibindo grande potencial como ferramenta de diagnóstico e/ou candidatos vacinais. Atualmente existem cinco genes pertencentes à extensa família de proteínas SRSs descritos na literatura científica para N. caninum, dos quais dois foram caracterizados de taquizoítas por serem altamente reconhecidos por soros de animais infectados: NcSRS29B (SAG1) e NcSRS29C (SRS2). Diante disso, este trabalho foi realizado com o objetivo de caracterizar as proteínas de superfície SRS, NcSRS57 e NcSRS67. Além disso, foi obtido um panorama geral de proteínas ancoradas por GPI de N. caninum na linhagem Nc-1. Dentre os homólogos apicomplexas, NcSRS67 apresentou maior identidade e similaridade com Hammondia hammondi (HHA_450490), enquanto NcSRS57 revelou maior identidade e similaridade com Toxoplasma gondii (TgSRS57). NcSRS67 e NcSRS57 apresentaram a terceira maior semelhança entre os homólogos envolvidos no alinhamento estrutural. Estas duas proteínas SRS possuem doze resíduos de cisteína conservados que por predição formam seis pontes dissulfeto distribuídas em dois domínios SRS (D1 e D2), formando sanduiches de folhas ? e ? hélices associadas entre si. A sequência codificadora de NcSRS67 (sem o peptídeo sinal e sem a âncora GPI) foi clonada e expressa constitutivamente no plasmídeo pCR-Blunt II-TOPO-His6x. A forma nativa de NcSRS67 apresentou massa molecular de 35 kDa (predito 30.6 kDa sem peptídeo sinal e sem âncora GPI). A sequência rNcSRS57 (sem o peptídeo sinal e sem a âncora GPI) foi clonada em pET32, entretanto apenas um fragmento de 92 pb foi traduzido em relação a sequência clonada de 1074pb, devido a presença de stop códon oculto. Este evento gerou rNcSRS57 com massa molecular abaixo do esperado (19,5 kDa). NcSRS57 nativa apresentou massa de 43 kDa (predito sem peptídeo sinal e sem âncora GPI 31.14 kDa). Os efeitos inibitórios dos anticorpos policlonais anti-rNcSRS67, anti-rNcSRS57 e a associação destes sobre a adesão/invasão de taquizoítas foram investigados in vitro, resultando em uma inibição de 20% para o anticorpo anti-rNcSRS67, 16% para o anticorpo anti-rNcSRS57 e 11% para a associação destes dois anticorpos. NcSRS67 foi localizada sobre parte da superfície de taquizoítas, ao contrário de NcSRS57, que abrangeu toda a área da superfície destes parasitas. Apesar das inúmeras tentativas, as formas nativas de NcSRS67 e NcSRS57 obtidas por eletroforese 2D não foram identificadas por MS/MS. O tratamento de taquizoítas de N. caninum com a enzima fosfolipase C fosfatidilinositol (PI-PLC) específica, seguido de análises por MS/MS também gerou a identificação de proteínas de N. caninum, ii dentre elas as proteínas mais abundantes já identificadas no secretoma de N. caninum, NcSRS29B (SAG1) e NcSRS29C (SRS2). Dessa forma, os resultados obtidos neste estudo agregam conhecimentos sobre o parasita N. caninum e revelam-se úteis na busca e seleção de novos alvos a serem investigados contra a neosporose. / Neospora caninum is an obligate intracellular parasite of the Apicomplexa phylum, closely related to Toxoplasma gondii and responsible for abortion and loss of fertility in cattle, resulting in significant losses in the worldwide livestock. As part of its intracellular cycle, the first interaction of the parasite with the target cell is performed by surface proteins known as SRS superfamily (Surface Antigen Glycoprotein - Related Sequences). SRS or SAG proteins have been subject of intensive research due to their immunodominant pattern, exhibiting great potential as a diagnostic tool and/or vaccine candidates. Currently there are five genes belonging to the SRS family of proteins described in the scientific literature for N. caninum. Two of these genes were isolated from tachyzoites due to their high sera reactivity of infected animals: NcSRS29B (SAG1) and NcSRS29C (SRS2). Therefore, this work was carried out with the aim of characterizing SRS surface proteins, NcSRS57 and NcSRS67. In addition, we have performed an overview of N. caninum GPI anchored proteins in the Nc-1 lineage. Our results showed that; among the apicomplexan homologues, NcSRS67 presented higher identity and similarity with Hammondia hammondi (HHA_450490), while NcSRS57 revealed greater identity and similarity with Toxoplasma gondii (TgSRS57). NcSRS67 and NcSRS57 presented the third major similarity between the homologues involved in the structural alignment. These two SRS proteins have twelve conserved cysteine residues predicted to form six disulfide bonds distributed in two SRS domains (D1 and D2), forming ?-sheet sandwiches and ?-helices associated with each other. The coding sequence of NcSRS67 (without the signal peptide and without the GPI anchor) was cloned and constitutively expressed in the plasmid pCR-Blunt II-TOPO-His6x. The native form of NcSRS67 has a molecular mass of 35 kDa (predicted 30.6 kDa without signal peptide and without the GPI anchor). The rNcSRS57 sequence (without the signal peptide and without the GPI anchor) was cloned into pET32, however only a 92 bp fragment was translated in contrast to the cloned sequence of 1074 bp, due to the presence of a hidden stop codon. This event generated rNcSRS57 with molecular mass lower than expected (19.5 kDa). Native NcSRS57 has 43 kDa mass (predicted without signal peptide and without GPI anchor 31.14 kDa). The inhibitory effects of the anti-rNcSRS67 polyclonal antibodies, anti-rNcSRS57 and the association of both on the adhesion/invasion of tachyzoites were investigated in vitro, resulting in a 20% inhibition for the anti-rNcSRS67 antibody, 16% rNcSRS57 and 11% for the association. NcSRS67 was localized on part of the surface of tachyzoites, unlike NcSRS57, which covered the entire surface area of these parasites. Despite of the iv numerous attempts, native forms of NcSRS67 and NcSRS57 obtained by 2D electrophoresis were not identified by MS/MS. The treatment of N. caninum tachyzoites with the specific phospholipase C phosphatidylinositol (PI-PLC) enzyme, followed by MS/MS analysis also generated the identification of N. caninum proteins, among them the most abundant proteins already identified in the secretome of N. caninum, NcSRS29B (SAG1) and NcSRS29C (SRS2). Thus, the results obtained in this study increase the knowledge of the parasite N. caninum and demonstrate to be useful in the search and selection of new targets to be investigated against neosporosis.

A malaria humana é uma doença infecciosa transmitida por um mosquito que está atrelada a uma alta taxa de mortalidade. Dentre os parasitas que causam a malaria humana a espécie Plasmodium falciparum é responsável por 90% dos casos letais. Sua virulência é ocasionada por modificações na célula hospedeira provenientes do tráfego de proteínas para a superfície de eritrócitos infectados. Com o intuito de interferir com estas proteínas, aplicamos a técnica Cell- SELEX (do inglês: Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). Após ciclos iterativos de seleção obtivemos moléculas de DNA simples- fita, conhecidas como aptâmeros, que possuem alta afinidade e especificidade contra proteínas alvo presentes na superfície de eritrócitos infectados por P. falciparum. Ensaios de pull- down usando aptâmeros selecionados em sistema de purificação por streptavidina-biotina seguidos por análises de espectrometria de massa revelaram a interação destas moléculas de DNA com proteínas como RIFIN, PfEMP, RAP1, entre outras incorporadas na superfície de eritrócitos infectados. Como consequência destas interações, os aptâmeros selecionados demostraram ser inibidores potenciais na proliferação dos parasitas, como demonstrado por testes in vitro. Outra estratégia usada foi a produção de aptâmeros contra a piridoxal quinase de P. falciparum (PfPdxK) expressa. Usando tanto SELEX-proteína, bem como, ensaios de eletroforese capilar, selecionamos aptâmeros com capacidade para inibir a atividade enzimática da PfPdxK. Nossos dados constituem evidências sobre as aplicações da tecnologia SELEX no desenho racional de compostos contra a malária humana. / The human malaria is a mosquito-borne infectious disease associated with a high risk of mortality. Among the parasite species that causes human malaria, Plasmodium falciparum is responsible by 90% of the lethal cases. The virulence of this pathogen is associated with host cell modifications by trafficking proteins to the surface of infected erythrocytes. Aiming to interfere with these proteins we have applied the Cell-SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) technology. After iterative cycles of selection we obtained single stranded DNA molecules, known as aptamers, with high binding affinity and specificity against protein targets present in the surface of erythrocytes infected with P. falciparum. Pull-down assays using the selected aptamers in a streptavidin-biotin affinity assay followed by mass spectrometry analysis revealed the interaction of these DNA molecules with proteins such as RIFIN, PfEMP, RAP1, among others embedded in the surface of infected erythrocytes. As consequence of these interactions, the selected aptamers demonstrated to be potent inhibitors of parasite proliferation, as validated by in vitro tests. Another strategy used was the production of aptamers against the recombinantly expressed plasmodial pyridoxal kinase (PfPdxK). Using both protein-SELEX as well as capillary electrophoresis assays, we selected aptamers with capacity to inhibit the enzymatic activity of PfPdxK. Our data constitute evidences about the application of SELEX technology in the rationale design of inhibitors against human malaria.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-04-20T12:49:28Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Alex Jesus de Carvalho - 2014.pdf: 1685689 bytes, checksum: 5b4f38809e4a3fe6252bba20b25d949b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-04-20T12:58:32Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Alex Jesus de Carvalho - 2014.pdf: 1685689 bytes, checksum: 5b4f38809e4a3fe6252bba20b25d949b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-20T12:58:33Z (GMT). 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The peptides obtained were treated by trypsin, reduced, alkylated and identified by nano-chromatography using a nanoACQUITY UPLCTM system (Waters) coupled to a SYNAPT Q-TOF mass spectrometer (Waters). The homology analysis was performed using the software ProteinLynx 2.3 (Waters). Through the shaving, it was possible to identify 219 proteins, many of them, described as virulence factors. Of total, 01 is cell wall protein, 09 are extracelular proteins, 19 are membrane proteins and 190 are citoplasmatic proteins. Besides of the lysis process, the presence of cytoplasmic proteins on cell surface can be due to the activity of export pathways not yet identified and many of these proteins can be proteins with moonlighting function, in other words, proteins that plays more of one function, it can, in this case, plays functions on S. saprophyticus cell surface related to bacterial virulence. The main proteins with moonlighting function include metabolic enzymes of the glycolytic pathway; enzymes of other metabolic pathways, such as, glyoxalate cycle; chaperones and proteins related with the proteic folding. The prediction of cellular localization was performed through LocateP database. The results of this research help to elucidate the strategies and machineries used by proteins during the adhesion, infection and proliferation, leading us to understand the interaction between the pathogenic bacteria S. saprophyticus and the human host. The knowledge about the proteins present on the cell surface is of extreme importance, because many of these proteins represent targets to new drugs, therapeutic antibodies or vaccines, since the pathogen cell surface is the first to contact with the host cells during the infection process. / A bactéria Gram-positiva Staphylococcus saprophyticus, uma das bactérias estafilococos coagulase negativa, é o segundo agente mais comum causador de infecções do trato urinário, afetando principalmente mulheres sexualmente ativas. S. saprophyticus pode causar doenças agudas como pielonefrite, sepse, nefrolitíase, endocardite, uretrite, epididimite e prostatite. Este trabalho teve como objetivo identificar proteínas de superfície de S. saprophyticus pela abordagem de shaving proteolítico, uma metodologia que foi estabelecida para identificar proteínas que possuem domínios proteicos na superfície celular utilizando a tripsinização de células intactas. Posteriormente, os peptídeos obtidos foram tripsinizados, reduzidos, alquilados e identificados através de nano-cromatografia utilizando um sistema nanoACQUITY UPLCTM (Waters) acoplado a um espectrômetro de massas SYNAPT Q-TOF (Waters). Com isso foi possível identificar 219 proteínas, muitas delas descritas como fatores de virulência. Do total, 01 proteína é de parede celular, 09 extracelulares, 19 de membrana e 190 citoplasmáticas. Além do processo de lise, a presença de proteínas citoplasmáticas na superfície celular pode ser devida à atividade de vias de exportação ainda não identificadas e muitas dessas proteínas podem ser proteínas com função moonlighting, ou seja, proteínas que desempenham mais de uma função, podendo, neste caso, desempenhar funções na superfície de S. saprophyticus relacionadas à virulência bacteriana. As principais proteínas com função moonlighting incluem enzimas metabólicas da via glicolítica; enzimas de outras vias metabólicas, tais como, ciclo do glioxalato; chaperonas e proteínas relacionadas com o dobramento proteico. A predição de localização celular foi realizada com o banco de dados LocateP. Os resultados desta pesquisa contribuíram na elucidação das estratégias e maquinarias utilizadas pelas proteínas durante a adesão, infecção e proliferação, levando-nos a compreender a interação entre a bactéria patogênica S. saprophyticus e o hospedeiro humano. O conhecimento acerca das proteínas presentes na superfície celular é de extrema importância, visto que muitas dessas proteínas representam alvos para novas drogas, anticorpos terapêuticos ou vacinas, uma vez que a superfície celular do patógeno é a primeira a entrar em contato com as células do hospedeiro durante o processo de infecção.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5298.pdf: 2436195 bytes, checksum: 47a2b6b8993059d60e028c4518c3ca75 (MD5) Previous issue date: 2013-05-24 / Universidade Federal de Sao Carlos / The citrus canker is an economically important disease for citrus crop. At the moment, there is no effective means of prevention or cure for this disease, which has contributed to citrus canker wide distribution around the world. The etiologic agents are bacteria of the genus Xanthomonas classified into two species, X. citri and X. fuscans. This study aimed to perform the differential proteomic analysis of cell surface proteins of Xanthomonas citri subsp. citri (XAC), the more virulent specie, between infectious (in vivo) and non-infectious (in vitro) conditions of growth. Additionally, the same analysis was performed by shotgun for XAC against the Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii type B (XauB), less virulent specie, both after growth in vivo. Initially, we performed growth curves of both bacteria on leaves of a common citrus host (Citrus aurantifolia) in order to investigate the dynamics of population growth in vivo and the efficiency of cell recovery by two different methods. For proteomic analysis, intact bacterial cells had their surface proteins labeled with fluorescence (DIGE CyDye Fluor minimal dyes), were then lysed and the total protein extract analyzed by differential gel electrophoresis (2D-DIGE), as standardized in this study. Protein profiles were analyzed by DeCyder 7.0 software and spots differentially expressed (ANOVA p <0.05) were isolated from gels, identified by mass spectrometry and search in protein databases of the annotated genome sequence of the bacteria. Seventy-nine spots from XAC were analyzed and thirty different proteins were identified, of which 10 correspond to known membrane or cell surface proteins: Ton-B dependent receptors and OmpA-related proteins exhibited lower expression in infectious condition, differently of Ferric enterobactin receptors, 60 kDa chaperonin (GroEL) and DnaK which showed higher expression after host interaction. XAC and XauB total extraction analysis by shotgun identified just two XAC proteins. Cell surface proteins with increased in vivo expression in virulent strain (XAC) could provide future targets of biotechnological interest for fighting citrus canker for being possibly related to phytopathogenicity and/or host spectrum. / O cancro cítrico é uma doença economicamente importante para a citricultura. Devido à inexistência de medidas eficazes de prevenção e combate, o cancro cítrico ainda é uma doença de ampla distribuição. Os agentes etiológicos são bactérias do gênero Xanthomonas, sendo classificadas em duas espécies, X. citri e X. fuscans, as quais diferem em virulência e espectro de hospedeiros cítricos. Este trabalho teve como objetivo a análise diferencial do subproteoma da superfície celular de Xanthomonas citri subsp. citri (XAC), espécie mais virulenta e causadora da cancrose A, entre duas condições de crescimento, infectante (in vivo) e não infectante (in vitro). Adicionalmente, a análise proteômica total por shotgun (LC-MS/MS) foi realizada para comparação de XAC com Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii tipo B (XauB), espécie menos virulenta, ambas após crescimento in vivo. Inicialmente, foram realizadas curvas de crescimento de ambas as bactérias em folhas de um hospedeiro cítrico comum (Citrus aurantifolia) a fim de se conhecer a dinâmica de crescimento populacional in vivo e a eficiência da recuperação bacteriana por dois diferentes métodos. Para as análises proteômicas, células bacterianas intactas tiveram suas proteínas de superfície marcadas com fluorescência (CyDye DIGE Fluor minimal dyes) e em seguida foram lisadas, sendo o extrato proteico total analisado por eletroforese diferencial em gel bidimensional (2D-DIGE), técnica padronizada neste trabalho. Os perfis proteicos de XAC foram analisados pelo software DeCyder 7.0 (GE Healthcare) e spots com expressão diferencial (ANOVA p<0,05) foram isolados dos géis e identificados por espectrometria de massas seguida de busca pela ferramenta Mascot em bancos de proteínas anotadas a partir da sequência genômica. Dos 79 spots de XAC analisados foram identificadas 30 diferentes proteínas, sendo que 10 correspondem a proteínas reconhecidamente de membrana e/ou superfície celular: receptores dependentes de Ton-B e proteínas relacionadas a OmpA foram encontradas com menor expressão na condição in vivo, enquanto que receptor de enterobactina, chaperonina 60 kDa (GroEL) e DnaK apresentaram maior expressão após interação com hospedeiro cítrico. Em relação à comparação do extrato total de XAC e XauB por shotgun foi possível identificar apenas duas proteínas de XAC. Proteínas da superfície celular com maior expressão na linhagem virulenta (XAC) na condição in vivo poderão ser futuros alvos de interesse biotecnológico para combate ao cancro cítrico por estarem possivelmente relacionadas com a fitopatogenicidade e/ou maior espectro de hospedeiros cítricos.