The Fanconi anemia (FA) pathway is a replication-dependent DNA repair mechanism which is essential for the removal of interstrand crosslink (ICL) DNA damages in higher eukaryotes (Moldovan and D’Andrea, 2009). Malfunctions in this highly regulated repair network lead to genome instability (Deans and West, 2011). Pathological phenotypes of the disease FA which is caused by mutations in the eponymous pathway are very heterogeneous, involving congenital abnormalities, bone-marrow failure, cancer predisposition and infertility (Auerbach, 2009). The FA pathway comprises a complex interaction network and to date 16 FA complementation groups and associated factors have been identified (Kottemann and Smogorzewska, 2013). Additionally, components of nucleotide excision repair (NER), homologous recombination repair (HRR), and translesion synthesis (TLS) are involved and coordinated by the FA proteins (Niedzwiedz et al., 2004; Knipscheer et al., 2009). One of the FA proteins is the DEAH helicase FANCM. In complex with its binding partners FAAP24 and MHF1/2 it binds the stalled replication fork and activates the FA damage response (Wang et al., 2013). However, the exact steps towards removal of the ICL damage still remain elusive.
To decipher the underlying process of FA initiation by FANCM, this thesis mainly focuses on the archaeal FANCM homolog helicase-associated endonuclease for fork-structured DNA (Hef). Hef from the archaeal organism Thermoplasma acidophilum (taHef) differs from other archaeal Hef proteins and exclusively comprises an N-terminal helicase entity with two RecA and a thumb-like domain while others additionally contain a nuclease portion at the C-terminus. I solved the crystal structure of full-length taHef at a resolution of 2.43 Å. In contrast to the crystal structure of the helicase domain of Hef from Pyrococcus furiosus (pfHef), taHef exhibits an extremely open conformation (Nishino et al., 2005b) which implies that a domain movement of the RecA-like helicase motor domains of 61° is possible thus highlighting the flexibility of helicases which is required to translocate along the DNA. However, small-angle x-ray scattering (SAXS) measurements confirm an intermediate conformation of taHef in solution indicating that both crystal structures represent rather edge states. Most
importantly, proliferating cell nuclear antigen (PCNA) was identified as an interaction partner of Hef. This interaction is mediated by a highly conserved canonical PCNA interacting peptide (PIP) motif. Intriguingly, the presence of PCNA does not alter the ATPase nor the helicase activity of taHef, thus suggesting that the interaction is entirely dedicated to recruit taHef to the replication fork to fulfill its function. Due to a high level of flexibility the taHef-taPCNA complex could not be crystallized and therefore SAXS was utilized to determine a low-resolution model of this quaternary structure.
This newly discovered PCNA interaction could also be validated for the eukaryotic FANCM homolog Mph1 from the thermophilic fungus Chaetomium thermophilum (ctMph1). As the first step towards the characterization of this interaction I solved the crystal structure of PCNA from Chaetomium thermophilum (ctPCNA).
Furthermore, it was possible to achieve preliminary results on the putative interaction between the human proteins FANCM and PCNA (hsFANCM, hsPCNA). In collaboration with Detlev Schindler (Human Genetics, Würzburg) and Weidong Wang (National Institute on Aging, Baltimore, USA) co-immunoprecipitation (CoIP) experiments were performed using hsFANCM and hsPCNA expressed in HEK293 cells. Although an interaction was reproducibly observed in hydroxyurea stimulated cells
further experiments and optimization procedures are required and ongoing. / Der Fanconi Anämie (FA) Signalweg ist ein replikationsabhängiger DNA-Reparaturmechanismus, der grundlegend zur Beseitigung von DNA-Schäden in Form von intermolekularen Quervernetzungen (ICL) beiträgt (Moldovan and D’Andrea, 2009). Fehlfunktionen in diesem stringent regulierten Reparaturnetzwerk führen somit zu Genominstabilität (Deans and West, 2011). Der pathologische
Phänotyp der Krankheit FA, die durch Mutationen in dem gleichnamigen DNA-Reparatur Signalweg verursacht wird, ist sehr heterogen und umfasst angeborene Deformationen, Knochenmarksversagen, eine erhöhte Tumor Disposition sowie Infertilität (Auerbach, 2009). Der FA Mechanismus ist ein komplexes Netzwerk und bisher wurden 16 FA Komplementationsgruppen sowie weitere beteiligte Faktoren identifiziert (Kottemann and Smogorzewska, 2013). Zusätzlich sind Komponenten der Nukleotid-Exzisionsreparatur (NER), der homologen Rekombinationsreparatur (HRR) und Transläsionssynthese (TLS) involviert, die durch FA Proteine koordiniert werden (Niedzwiedz et al., 2004; Knipscheer et al., 2009). Eines der FA Proteine ist die DEAH Helikase FANCM. Im Komplex mit seinen Interaktionspartnern FAAP24 und MHF1/2 bindet FANCM an die durch den ICL Schaden zum Stillstand gekommene Replikationsgabel und aktiviert die FA Schadensantwort (Wang et al., 2013). Die weiteren Schritte, die zur Entfernung des ICL Schadens führen, sind jedoch weitestgehend ungeklärt.
Zur Aufklärung der Initiation des FA Mechanismus und der Rolle, die das FANCM dabei spielt, wurde in dieser Arbeit hauptsächlich das archaische FANCM Homolog Helicase-associated Endonuclease for Fork-structured DNA (Hef) analysiert. Hef aus dem archaischen Organismus Thermoplasma acidophilum (taHef) unterscheidet sich von anderen archaischen Hef Proteinen und besteht ausschließlich aus einem N-terminalen Helikase-Abschnitt mit zwei RecA und einer thumb-like Domäne, während andere Hef Proteine am C-Terminus zusätzlich eine Nuklease-Domäne besitzen. Ich habe die Kristallstruktur des taHef Proteins bei einer Auflösung von 2,43 Å gelöst. Im Gegensatz zur Kristallstruktur eines vergleichbaren Hef-Konstruktes aus Pyrococcus
furiosus (pfHef) (Nishino et al., 2005b) liegt in taHef eine extrem offene Konformation der beiden RecA-Domänen vor, was impliziert, dass eine Bewegung der RecA-ähnlichen Helikase Motordomänen um 61° möglich ist und zudem die zur Translokation entlang der DNA notwendige Flexibilität von Helikasen verdeutlicht. Messungen mittels Kleinwinkelröntgenstreuung (SAXS) deuten hingegen auf eine intermediäre Konformation des taHef Proteins in Lösung hin, wodurch beide Kristallstrukturen als eher Randzustände angesehen werden können. Besonders hervorzuheben ist, dass das Protein Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) als Hef Interaktionspartner identifiziert wurde. Diese Interaktion wird durch ein hoch-konserviertes kanonisches PCNA Interaktionspeptid-Motiv vermittelt. Interessanterweise beeinflusst PCNA aber weder die ATPase noch die Helikase Aktivität von taHef, was darauf hindeutet, dass diese Interaktion nur zur Rekrutierung des Hef Proteins zur Replikationsgabel dient. Wegen des hohen Maßes an Flexibilität konnte der taHef-taPCNA Komplex nicht kristallisiert werden, wohingegen SAXS Messungen erfolgreich waren und ein Model bei niedriger Auflösung konnte erhalten werden.
Diese nachgewiesene Interaktion zwischen Hef und PCNA konnte auch für das eukaryotische FANCM Homolog Mph1 aus dem thermophilen Pilz Chaetomium thermophilum (ctMph1) bestätigt werden. Als ersten Schritt zur Charakterisierung dieser Interaktion habe ich die Kristallstruktur von PCNA aus Chaetomium thermophilum (ctPCNA) gelöst.
Weiterhin war es möglich, vorläufige Resultate bezüglich der mutmaßlichen Interaktion zwischen den humanen Proteinen FANCM und PCNA (hsFANCM,
hsPCNA) zu erhalten. In Kooperation mit Detlev Schindler (Humangenetik, Würzburg) und Weidong Wang (National Institute on Aging, Baltimore, USA) wurden Co-Immunopräzipitations-Experimente (CoIP) mit humanem FANCM und humanem PCNA aus HEK293-Zellen durchgeführt. Obwohl eine Interaktion in Hydroxyurea-stimulierten Zellen reproduzierbar nachgewiesen werden konnte, sind
weitere Experimente notwendig, um diese Interaktion zu charakterisieren.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:11312 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Rohleder, Florian |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/doku/lic_mit_pod.php, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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