Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / No autorizada por el autor para ser publicada a texto completo en el Portal de Tesis Electrónicas / Las arañas del género Loxosceles son un grupo numeroso de especies repartidas por
todo el mundo, encontrándose en Chile únicamente la Loxosceles laeta. Se conocen
popularmente como arañas de rincón, viven exclusivamente junto al hombre y lo
muerden solo si se ven amenazadas. La mordedura de la araña provoca en el hombre
una condición clínica denominada loxoscelismo, que puede ser de compromiso
cutáneo con necrosis de la piel afectada (loxoscelismo cutáneo) o de compromiso
sistémico con hemólisis generalizada, pudiendo provocar la muerte por falla renal
severa (loxoscelismo viscerocutáneo). El veneno está compuesto por toxinas proteicas
de bajo peso molecular, siendo solo una de ellas, la esfingomielinasa D (SMD) o
fosfolipasa D, capaz de emular los efectos nocivos del veneno completo.
Los tratamientos para el loxoscelismo se basan en medidas de sostén y pese a que
existe un antisuero equino disponible en el país, no se usa debido al riesgo de provocar
reacción anafiláctica y a su eficacia no comprobada. Tal como los anticuerpos, los
aptámeros son moléculas de RNA o DNA capaces de unirse fuerte y específicamente a
su molécula blanco. Los aptámeros capaces de bloquear la SMD se presentan como
una alternativa segura y eficaz para tratar el loxoscelismo: no son inmunogénicos, son
muy específicos, económicos y fáciles de obtener a través de la selección iterativa
(SELEX) de un universo de moléculas de RNA o DNA de secuencia aleatoria.
En este trabajo se sintetizó de novo el cDNA de la SMD isoforma Ll1 de la Loxosceles
laeta mediante polimerización por PCR de oligonucleótidos que se sobrelapan, se
clonó en un vector bacteriano de expresión y se generó la proteína recombinante
(34,1 kDa) en Escherichia coli. Con la proteína purificada se realizaron dos procesos
de selección iterativa por afinidad partiendo de 3,6x1013 moléculas de RNA de 107
nucleótidos siendo los 60 centrales aleatorios. Los procesos, de 10 y 12 ciclos, se
efectuaron a relaciones molares de proteína:RNA de 1:5 y 1:10, respectivamente,
obteniendo conjuntos de RNAs con hasta ~40% (ciclo 10, 1:5) y ~25% (ciclo 8, 1:10) de
capacidad inhibitoria de la actividad esfingomielinásica. Este trabajo es el primer
acercamiento a la obtención de aptámeros individuales que constituyan la base
molecular de un medicamento biotecnológico de RNA y de un método diagnóstico para
el envenenamiento por Loxosceles laeta, araña endémica del país y el animal
ponzoñoso de mayor importancia clínica en Chile. / Spiders of the genus Loxosceles are a large group of species spread worldwide,
Loxosceles laeta being the only species found in Chile. It is commonly known as brown
spider, it lives exclusively with man and only bites when threatened. The spider bite
causes a clinical condition called loxoscelism characterized by cutaneous necrosis of
the affected site (cutaneous loxoscelism) or systemic involvement with hemolysis, that
can cause death due to severe kidney failure (viscerocutaneous loxoscelism). The
venom toxins are low molecular weight proteins, only one of which is capable of
emulating the harmful effects of whole venom: sphingomyelinase D (SMD) or
phospholipase D.
Treatment for loxoscelism is based solely on supportive measures. Although an equine
antiserum is available in Chile it is not used because of the risk of anaphylactic
reactions and unproven efficacy. Similarly to antibodies, aptamers are RNA or DNA
molecules capable of binding strongly and specifically to their target. Thus, aptamers
which bind to SMD and block it may provide a safe and effective alternative for treating
loxoscelism: they are not immunogenic, are highly specific, economic and easy to
obtain through iterative selection (SELEX) from a universe of RNA or DNA molecules of
random sequence.
In this work the cDNA of the LI1 isoform of Loxosceles laeta sphingomyelinase D was
synthesized de novo by PCR polymerization of overlapping oligonucleotides, cloned in
a bacterial expression vector, and used to generate the recombinant protein (34.1 kDa)
in Escherichia coli. Two iterative selection processes were performed with the purified
protein, selecting aptamers by affinity for SMD-Ll1 from a pool of 3.6x1013 RNA
molecules of 107 nucleotides having a core of 60 nucleotides of random sequence.
Each selection process was performed with a protein to RNA ratio of either 1:5 (10
cycles) or 1:10 (12 cycles). The ability of these RNA pools to inhibit SMD-Ll1
sphingomyelinase activity reached ~40% (cycle 10, 1:5) and ~25% (cycle 8, 1:10). This
work is the first biotechnological approach to obtain RNA aptamers with therapeutic and
diagnostic potential for loxoscelism, disease caused by the poisonous animal having
the greatest medical relevance in Chile / Fondecyt 1100209
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/111621 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Constenla Muñoz, Carlos Alberto |
| Contributors | Sapag Muñoz de la Peña, Amalia, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Departamento de Química Farmacológica y Toxicológica, Laboratorio de Farmacoterapia Génica |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
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