A resistência aos antibióticos adquirida por micro-organismos patogênicos é um problema de saúde mundial e, por isso, o desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos vem sendo amplamente estimulado. Sabendo que muitos peptídeos bioativos correspondem a fragmentos peptídicos de proteínas e/ou seus análogos, este trabalho teve o objetivo de desenvolver novos peptídeos antimicrobianos (AMPs) a partir das sequências aminoacídicas e das estruturas 3D de proteínas possivelmente envolvidas na atividade antimicrobiana de venenos de serpentes pouco estudados. As etapas iniciais seguidas foram: a) escolher uma fosfolipase A2 (PLA2) de veneno de serpente peruana do gênero Bothrops da família Viperidae com sequência de aminoácidos conhecida e modelar por homologia a sua estrutura 3D; b) verificar atividade antimicrobiana em venenos de serpentes peruanas dos gêneros Bothrops e Bothriopsis da família Viperidae, selecionar um veneno ativo, fracioná-lo para isolar proteínas provavelmente envolvidas nessa atividade, tripsinizar as proteínas isoladas, sequenciar os fragmentos trípticos para identificá-las, localizar esses fragmentos em sequências aminoacídicas de proteínas com estruturas 3D disponíveis correlatas às proteínas isoladas/identificadas em classe, função e fonte natural. Em seguida, foram escolhidos fragmentos peptídicos da PLA2 (item a) e das proteínas isoladas do veneno ativo (item b) e/ou desenhados análogos que apresentassem características exibidas por AMPs conhecidos. Os peptídeos desenhados foram sintetizados, purificados, caracterizados e testados em suas atividades antimicrobianas. Os modelos estruturais 3D da PLA2 de Bothrops pictus e quatro peptídeos (PLA2-1 a -4) amidados derivados dela foram obtidos, sendo o PLA2-1 ativo frente a Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Candida krusei e Candida parapsilosis (MICs de 6,25-200 µmol.mL-1). Dos três venenos de serpentes peruanas testados, Bothrops taeniatta, Bothrops barnetti e Bothriopsis oligolepis, os dois últimos inibiram o crescimento de S. aureus (MICs 0,78-50 µmol.mL-1), mas apenas B. oligolepis demonstrou espectro de ação amplo. O seu fracionamento sequencial, acompanhado de ensaios de inibição do crescimento de S. aureus, gerou frações ativas relativamente homogêneas que, tripsinizadas e os fragmentos trípticos sequenciados, continham metalo-peptidases do tipo III, serino-peptidase ou lectinas do tipo C. A verificação de atividade enzimática e de coagulação sanguínea nessas frações confirmaram as naturezas das proteínas isoladas. Dos três peptídeos amidados (Bo-Ser1, Bo-Met1 e Bo-Lec1) desenhados a partir de suas estruturas, um deles foi ativo frente às leveduras C. albicans, C. krusei e C. parapsilosis (Bo-Met1; MIC de 6,25 - 200 µmol.mL-1). Pela primeira vez, foi demonstrado que: a) os venenos das serpentes peruanas B. barnetti e B. oligolepis apresentam ação antimicrobiana, sendo o último de espectro amplo; b) que as proteínas acima citadas, que incluem uma serino-peptidase, estão envolvidas com essa propriedade do veneno de B. oligolepis; c) que as sequências aminoacídicas e modelo 3D de uma PLA2 ácida e de proteínas presentes nos venenos das serpentes peruanas B. pictus e Bothriopsis oligolepis podem funcionar como fontes naturais para o desenvolvimento de novos AMPs de ação potente em micro-organismos de interesse clínico e científico. / Resistance to antibiotics obtained by pathogenic microorganisms is a global health problem, so the search for new antimicrobial agents has been encouraged. Knowing that many protein fragments and analogues are bioactive peptides, the aim of this work was to develop new antimicrobial peptides (AMPs) based on the amino acid sequences and 3D structures of proteins apparently involved in the antimicrobial activity of snake venoms very little or not studied so far. The first steps taken were: a) selection of a phospholipase A2 (PLA2) present in the venom from a Peruvian Bothrops sp. belonging to the family Viperidae, whose amino acid sequence was known, to model by homology its 3D structure; b) detection of antimicrobial activity in venoms from other Peruvian Viperidae Bothrops and Bothriopsis snakes, selection of an active venom, fractionation of it for isolation of proteins possibly involved in the antimicrobial activity, trypsinization of the isolated proteins, sequencing of the tryptic fragments for protein identification, location of such fragments in the amino acid sequences and 3D structures of proteins directly related in class, function and natural source to the isolated proteins. Then, peptide fragments from the chosen PLA2 (item a) and from the isolated proteins (item b) that presented structural features found in the known AMPs were selected and/or their analogues were designed. Finally, synthesis, purification and characterization of the peptides with AMP potential, (viii) verification on whether or not they display antimicrobial activity. The 3D-structure models of Bothrops pictus PLA2 and four amidated peptides (PLA2-1 to -4) derived from it were obtained, being PLA2-1 active against Gram negative bacteria Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa as well as the yeasts Candida albicans, Candida krusei and Candida parapsilosis (MICs de 6.25-200 µmol.mL-1). Among the three Peruvian snake venoms tested Bothrops taeniatta, Bothrops barnetti and Bothriopsis oligolepis, the last two inhibited the growth of S. aureus (MICs 0.78-50 µmol.mL-1) and B. oligolepis presented a wide spectrum of bacterial action. Sequential fractionation followed by S. aureus growth inhibition assays of the main fractions led to active relatively homogeneous ones. Their trypsinization and sequencing of the tryptic fragments indicated that they contained metalloproteinases type III, serine-proteinase or lectins type CTL. Enzymatic activity and blood coagulation assays confirmed the nature of the isolated proteins. From the three amidated peptides (Bo-Ser1, Bo-Met1 e Bo-Lec1) derived from them, Bo-Met1 showed to be active against C. albicans, C. krusei e C. parapsilosis (MIC 6,25 - 200 µmol.mL-1). In summary, for the first time, it was demonstrated that: a) the venoms of the Peruvian snakes B. barnetti and B. oligolepis display antimicrobial activity, being the last of wide spectrum of action, b) the proteins isolated from B. oligolepis snake venom, including a serine-peptidase, are involved in the antimicrobial activity of the B. oligolepis snake venom, c) the amino acid sequences and 3D structures of acidic PLA2 and of other proteins found in the venoms of the Peruvian B. pictus e Bothriopsis oligolepis snakes can be used as safe and natural sources for the development of new AMPs potent against microorganisms of clinical and scientific interest.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-11042017-083735 |
| Date | 21 November 2016 |
| Creators | López, Marcos Alejandro Sulca |
| Contributors | Machini, Maria Teresa |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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