Bacteriocinas são peptídeos com atividade bactericida ou bacteriostática para espécies sensíveis ao produto bacteriano. Estas substâncias são compostos heterogêneos em relação à massa molecular, propriedades bioquímicas, espectro inibitório e mecanismos de ação. Apesar dos trabalhos realizados quanto à biodiversidade da Amazônia, poucos estudos são desenvolvidos com o objetivo de investigar a complexidade genética e o potencial biotecnológico desta região, principalmente quando se trata de micro-organismos. Neste âmbito, o presente trabalho teve como objetivo verificar a presença de genes de bacteriocinas produzidas por diferentes linhagens de Bacillus isoladas de intestino de peixes da Região Amazônica, Brasil. Os PCRs mostraram que as cinco linhagens testadas apresentam o gene funcional codificante de malonil Coa transacilase (ituD), para o gene codificador da pré-subtilosina A (sboA) e para o gene codificador da pré-subtilina (spaS). Quatro isolados possuem também o suposto gene terminador transcricional (sfp). A inibição do crescimento de fungos fitopatogênicos caracterizou a atividade antimicótica dos isolados. A caracterização da atividade biossurfactante foi realizada pela presença de zonas de hemólise ao redor de cada colônia e atividade emulsificante. Análises realizadas por MALDI-TOF confirmam a produção de surfactina, iturina A, subtilina, subtilosina A e isoformas. Ao comparar as linhagens de Bacillus Amazônicos com Bacillus subtilis ATCC 19659 em relação ao nível de expressão de sboA e ituD, observou-se, de forma geral, um nível de expressão de sboA pelos isolados Amazônicos inferior a B. subtillis ATCC 19659. Em contraste, quando os níveis de ituD foram avaliados, percebeu-se que as linhagens Amazônicas exibiram altos níveis de expressão deste gene. Acredita-se que independente do controle regulatório a que estão subordinados os operons de iturina A e subtilosina A nas condições de estresse utilizadas por este estudo, os isolados de Bacillus possuem um nível basal de expressão diferenciado entre si e em relação à B. subtilis ATCC 19659. / Bacteriocins are peptides with bactericidal or bacteriostatic activity for species closely related to bacterial product. These substances are heterogeneous compounds in relation to molecular weight, biochemical properties, inhibitory spectrum and mechanisms of action. Despite the work done on the biodiversity of the Amazon, few studies were developed with the objective of investigating the genetic complexity and biotechnology potential in this region, especially when it comes to microorganisms. In this context, this study aimed to verify the presence of genes of bacteriocins produced by five strains of Bacillus isolated from aquatic environment of the Amazon region, Brazil. The PCRs showed that strains tested exhibit potential for the functional gene encoding for malonyl CoA transacilase (ituD), for the gene encoding prosubtilosin A (sboA), and the gene encoding prosubtilin (spaS). Four isolates also have potential for the putative transcriptional terminator gene (sfp). Inhibiting the growth of pathogenic fungi characterizes the antimycotic activity of the isolates. The characterization of biosurfactant activity is undertaken by the presence of zones of hemolysis around each colony, as well the emulsifying activity. Analyses carried out by MALDI-TOF mass spectrometry confirmed the production of surfactin, iturin A subtilin, subtilosin A and isoforms. By comparing Bacillus strains isolated from the Amazon region with Bacillus subtilis ATCC 19659 on the level of sboA and ituD expression, there was, overall, a level of sboA expression of the isolated Amazonian less than B. subtilis ATCC 19659. In contrast, when levels of ituD were evaluated, it was noticed that the Amazonian strains exhibited high levels of expression of this gene. It is believed that regardless of regulatory control that are the subject of iturin A and subtilosin A operons in stress conditions used in this study, isolates of Bacillus have a baseline level of expression is different among themselves and in relation to B. subtilis ATCC 19659.

Orientadora: Profa Dra Fernanda Dias da Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2016. / A microplusina e um peptideo antimicrobiano (PAM), quelante de cobre e ferro, presente no carrapato bovino Riphicephalus microplus. Possui estrutura globular, arranjada em cinco ¿¿-helices e e rica em residuos de cisteina e histidina. As histidinas His-2 e His-74 estao entre os possiveis residuos de aminoacidos envolvidos na formacao do sitio de ligacao ao cobre, de acordo com dados de RMN. Seu amplo espectro de atividade contra bacterias Gram-positivas e fungos pode estar associado a sua capacidade de quelar cobre e estudos com Micrococcus luteus e Cryptococcus neoformans, mostraram que a adicao de cobre ao meio anula o seu efeito bacteriostatico e fungistatico, respectivamente. A microplusina ao ligar cobre, possivelmente, diminui a disponibilidade deste metal, o que pode afetar a atividade de enzimas dependentes de cobre. Culturas de M. luteus e C. neoformans tratadas com o peptideo apresentaram uma reducao no seu consumo de oxigenio e dados sugerem que a deplecao de cobre pode ter afetado a atividade de heme cobre oxidases pertencentes a uma das vias da cadeia transportadora de eletrons. A microplusina tambem interfere na sintese de melanina de C. neoformans, o que pode estar relacionado a uma diminuicao da atividade da lacase, uma enzima cobre dependente. Esses dados indicam o enorme potencial da microplusina como farmaco e estudos sobre quais aminoacidos de sua sequencia sao importantes para manutencao de sua estrutura e atividades tornam-se essenciais. Sendo assim, o presente projeto propos como objetivo principal avaliar o efeito da substituicao das histidinas amino-terminais His-1 e His-2 por residuos de alanina, utilizando-se para isso, a expressao recombinante de duas variantes da microplusina (MPmH1A e MPmH2A). Os resultados demonstraram o surgimento inesperado de mais de uma molecula com atividade antimicrobiana para a variante MPmH1A, indicando que mais estudos serao necessarios para avaliar a atividade destes peptideos. Por sua vez a variante MPmH2A teve sua atividade antimicrobiana mantida mesmo sem a presenca do residuo de histidina 2 (His- 2). Porem em ambas nao foi possivel detectar a atividade quelante de cobre, indicando assim que atividade antimicrobiana pode ter ocorrido por outras vias, bem como que o residuo de histidina 2 pode ser essencial para a atividade quelante de cobre. / Microplusin is an antimicrobial and chelating peptide (AMP) for both copper II and iron II, present in the cattle tick Riphicephalus microplus. Its structure is globular, with five alpha helices and rich in cysteine and histidine residues. The histidines His-2 and His-74 are the possible amino acids involved in the copper-binding site. Its broad activity spectrum against Gram-positive bacteria and fungi may be associated with its ability to chelate copper and studies with Micrococcus luteus and Cryptococcus meoformans have shown the copper addition in the media abrogate its bacteriostatic and fungistatic effect, respectively. The binding of microplusin to copper, possibly decreases the metal availability in the media, which may affect the activity of copper dependent enzymes. In fact, M. luteus and C. neoformans cultures treated with microplusin, shown a reduction in their oxygen consumption and data suggest the copper depletion may have affected the activity of heme copper oxidases, belonging to one of the transport chain of electrons.This peptide also affects the melanization of C. neoformans. The melanization reduction is related to a lacase activity decrease, a copper dependent enzyme. Microplusin activities indicate its huge potential as a promising therapeutic and studies about which amino acids in its sequence are important to its structure maintenance and activities become essential. Therefore, the main objective of this project was evaluate the effect of amino-terminal histidines His-1 e His-2 substitution for alanine residues, using, for that, a recombinant expression of two microplusin variants (MPmH1A e MPmH2A). The results showed the unexpected onset of more than one molecule with antimicrobial activity for MPmH1A variant, indicating that more studies are necessary to evaluate the activity of these peptides. In turn, the MPmH2A variant had its antimicrobial activity maintained even without the presence of histidine residue 2 (His-2). However in both has not been possible detect the chelating activity of copper, indicating that antimicrobial activity may have happened by other means well as the residue of histidine 2 can be essential for the chelating activity of copper.

Bacteriocinas são peptídeos com atividade bactericida ou bacteriostática para espécies sensíveis ao produto bacteriano. Estas substâncias são compostos heterogêneos em relação à massa molecular, propriedades bioquímicas, espectro inibitório e mecanismos de ação. Apesar dos trabalhos realizados quanto à biodiversidade da Amazônia, poucos estudos são desenvolvidos com o objetivo de investigar a complexidade genética e o potencial biotecnológico desta região, principalmente quando se trata de micro-organismos. Neste âmbito, o presente trabalho teve como objetivo verificar a presença de genes de bacteriocinas produzidas por diferentes linhagens de Bacillus isoladas de intestino de peixes da Região Amazônica, Brasil. Os PCRs mostraram que as cinco linhagens testadas apresentam o gene funcional codificante de malonil Coa transacilase (ituD), para o gene codificador da pré-subtilosina A (sboA) e para o gene codificador da pré-subtilina (spaS). Quatro isolados possuem também o suposto gene terminador transcricional (sfp). A inibição do crescimento de fungos fitopatogênicos caracterizou a atividade antimicótica dos isolados. A caracterização da atividade biossurfactante foi realizada pela presença de zonas de hemólise ao redor de cada colônia e atividade emulsificante. Análises realizadas por MALDI-TOF confirmam a produção de surfactina, iturina A, subtilina, subtilosina A e isoformas. Ao comparar as linhagens de Bacillus Amazônicos com Bacillus subtilis ATCC 19659 em relação ao nível de expressão de sboA e ituD, observou-se, de forma geral, um nível de expressão de sboA pelos isolados Amazônicos inferior a B. subtillis ATCC 19659. Em contraste, quando os níveis de ituD foram avaliados, percebeu-se que as linhagens Amazônicas exibiram altos níveis de expressão deste gene. Acredita-se que independente do controle regulatório a que estão subordinados os operons de iturina A e subtilosina A nas condições de estresse utilizadas por este estudo, os isolados de Bacillus possuem um nível basal de expressão diferenciado entre si e em relação à B. subtilis ATCC 19659. / Bacteriocins are peptides with bactericidal or bacteriostatic activity for species closely related to bacterial product. These substances are heterogeneous compounds in relation to molecular weight, biochemical properties, inhibitory spectrum and mechanisms of action. Despite the work done on the biodiversity of the Amazon, few studies were developed with the objective of investigating the genetic complexity and biotechnology potential in this region, especially when it comes to microorganisms. In this context, this study aimed to verify the presence of genes of bacteriocins produced by five strains of Bacillus isolated from aquatic environment of the Amazon region, Brazil. The PCRs showed that strains tested exhibit potential for the functional gene encoding for malonyl CoA transacilase (ituD), for the gene encoding prosubtilosin A (sboA), and the gene encoding prosubtilin (spaS). Four isolates also have potential for the putative transcriptional terminator gene (sfp). Inhibiting the growth of pathogenic fungi characterizes the antimycotic activity of the isolates. The characterization of biosurfactant activity is undertaken by the presence of zones of hemolysis around each colony, as well the emulsifying activity. Analyses carried out by MALDI-TOF mass spectrometry confirmed the production of surfactin, iturin A subtilin, subtilosin A and isoforms. By comparing Bacillus strains isolated from the Amazon region with Bacillus subtilis ATCC 19659 on the level of sboA and ituD expression, there was, overall, a level of sboA expression of the isolated Amazonian less than B. subtilis ATCC 19659. In contrast, when levels of ituD were evaluated, it was noticed that the Amazonian strains exhibited high levels of expression of this gene. It is believed that regardless of regulatory control that are the subject of iturin A and subtilosin A operons in stress conditions used in this study, isolates of Bacillus have a baseline level of expression is different among themselves and in relation to B. subtilis ATCC 19659.

Bacteriocinas são peptídeos com atividade bactericida ou bacteriostática para espécies sensíveis ao produto bacteriano. Estas substâncias são compostos heterogêneos em relação à massa molecular, propriedades bioquímicas, espectro inibitório e mecanismos de ação. Apesar dos trabalhos realizados quanto à biodiversidade da Amazônia, poucos estudos são desenvolvidos com o objetivo de investigar a complexidade genética e o potencial biotecnológico desta região, principalmente quando se trata de micro-organismos. Neste âmbito, o presente trabalho teve como objetivo verificar a presença de genes de bacteriocinas produzidas por diferentes linhagens de Bacillus isoladas de intestino de peixes da Região Amazônica, Brasil. Os PCRs mostraram que as cinco linhagens testadas apresentam o gene funcional codificante de malonil Coa transacilase (ituD), para o gene codificador da pré-subtilosina A (sboA) e para o gene codificador da pré-subtilina (spaS). Quatro isolados possuem também o suposto gene terminador transcricional (sfp). A inibição do crescimento de fungos fitopatogênicos caracterizou a atividade antimicótica dos isolados. A caracterização da atividade biossurfactante foi realizada pela presença de zonas de hemólise ao redor de cada colônia e atividade emulsificante. Análises realizadas por MALDI-TOF confirmam a produção de surfactina, iturina A, subtilina, subtilosina A e isoformas. Ao comparar as linhagens de Bacillus Amazônicos com Bacillus subtilis ATCC 19659 em relação ao nível de expressão de sboA e ituD, observou-se, de forma geral, um nível de expressão de sboA pelos isolados Amazônicos inferior a B. subtillis ATCC 19659. Em contraste, quando os níveis de ituD foram avaliados, percebeu-se que as linhagens Amazônicas exibiram altos níveis de expressão deste gene. Acredita-se que independente do controle regulatório a que estão subordinados os operons de iturina A e subtilosina A nas condições de estresse utilizadas por este estudo, os isolados de Bacillus possuem um nível basal de expressão diferenciado entre si e em relação à B. subtilis ATCC 19659. / Bacteriocins are peptides with bactericidal or bacteriostatic activity for species closely related to bacterial product. These substances are heterogeneous compounds in relation to molecular weight, biochemical properties, inhibitory spectrum and mechanisms of action. Despite the work done on the biodiversity of the Amazon, few studies were developed with the objective of investigating the genetic complexity and biotechnology potential in this region, especially when it comes to microorganisms. In this context, this study aimed to verify the presence of genes of bacteriocins produced by five strains of Bacillus isolated from aquatic environment of the Amazon region, Brazil. The PCRs showed that strains tested exhibit potential for the functional gene encoding for malonyl CoA transacilase (ituD), for the gene encoding prosubtilosin A (sboA), and the gene encoding prosubtilin (spaS). Four isolates also have potential for the putative transcriptional terminator gene (sfp). Inhibiting the growth of pathogenic fungi characterizes the antimycotic activity of the isolates. The characterization of biosurfactant activity is undertaken by the presence of zones of hemolysis around each colony, as well the emulsifying activity. Analyses carried out by MALDI-TOF mass spectrometry confirmed the production of surfactin, iturin A subtilin, subtilosin A and isoforms. By comparing Bacillus strains isolated from the Amazon region with Bacillus subtilis ATCC 19659 on the level of sboA and ituD expression, there was, overall, a level of sboA expression of the isolated Amazonian less than B. subtilis ATCC 19659. In contrast, when levels of ituD were evaluated, it was noticed that the Amazonian strains exhibited high levels of expression of this gene. It is believed that regardless of regulatory control that are the subject of iturin A and subtilosin A operons in stress conditions used in this study, isolates of Bacillus have a baseline level of expression is different among themselves and in relation to B. subtilis ATCC 19659.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:55:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5622_1.pdf: 652971 bytes, checksum: 5cf0265224e3cb7b596a27276eaf94c4 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / A utilização de antibióticos pode ser considerada um dos principais avanços no tratamento de doenças infecciosas desde o século passado, entretanto, a redução da sensibilidade aos agentes antimicrobianos de uso corrente tem aumentado em uma grande variedade de patógenos e a resistência a múltiplas drogas tem sido comum a vários microrganismos. Esta diminuição tem sido observada quando se avalia, por exemplo, o perfil de sensibilidade de bacilos Gram-negativos como Escherichia coli frente aos betalactâmicos, uma classe de antibióticos muito utilizada clinicamente. A busca por novos medicamentos que possam trazer maior sucesso nos tratamentos, minimizando os casos de resistência microbiana, tem aumentado significativamente, e a química orgânica, através dos planejamentos e modificações moleculares tem contribuído em grande parte das descobertas. As tiazolidinas e imidazolidinas representam uma classe de compostos de grande interesse científico devido às suas propriedades químicas e ao extenso espectro de atividades biológicas. Neste trabalho, derivados tiazolidínicos e imidazolidínicos foram avaliados acerca da atividade antimicrobiana frente a bactérias e fungos. O caldo e o ágar Mueller-Hinton e Sabouraud foram usados para os testes e diluições seriadas dos compostos de concentrações variando entre 128μg/ml e 0,5μg/ml foram preparadas em Dimetilformamida(DMF). Os experimentos foram realizados em microplacas, incubadas em estufa bacteriológica, após as quais o conteúdo foi semeado em placas de Petri, contendo meio sólido, para análise da presença ou ausência de crescimento, sendo considerada a Concentração Inibitória Mínima(CIM) a menor concentração da droga para a qual não havia presença de colônias. Foi verificada atividade antimicrobiana frente a todos os compostos, estando o melhor resultado de CIM igual a 32μg/mL. O derivado imidazolidínico NN-41 foi utilizado para avaliação do efeito sinérgico, quando combinado com o antibiótico ampicilina sobre a bactéria Escherichia coli resistente (ATCC 35218). O teste de difusão em meio sólido, após a ação sinérgica, mostrou halo de inibição de 20mm, enquanto a ampicilina isolada mostrou halo 14mm, demonstrando que a combinação resultou em maior ação antibacteriana. A mesma bactéria foi avaliada, via microscopia eletrônica de transmissão acerca das alterações estruturais, após o tratamento com o composto NN-41, sendo observado alterações na morfologia da parede celular, formação de vacúolos e edemas intracelulares. Os resultados sugerem capacidade antimicrobiana dos novos derivados tiazolidínicos e imidazolidínicos utilizados, inclusive com potencial de utilização frente a uma bactéria Gram negativa multirresistente da espécie Escherichia coli de grande interesse clínico

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:55:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo9561_1.pdf: 666223 bytes, checksum: 4eeb4297cede9922bd396a7f3a8879d2 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / A utilização de antibióticos pode ser considerada um dos principais avanços no tratamento de doenças infecciosas desde o século passado, entretanto, a redução da sensibilidade aos agentes antimicrobianos de uso corrente tem aumentado em uma grande variedade de patógenos e a resistência a múltiplas drogas tem sido comum a vários microrganismos. Esta diminuição tem sido observada quando se avalia, por exemplo, o perfil de sensibilidade de bacilos Gram-negativos como Escherichia coli frente aos betalactâmicos, uma classe de antibióticos muito utilizada clinicamente. A busca por novos medicamentos que possam trazer maior sucesso nos tratamentos, minimizando os casos de resistência microbiana, tem aumentado significativamente, e a química orgânica, através dos planejamentos e modificações moleculares tem contribuído em grande parte das descobertas. As tiazolidinas e imidazolidinas representam uma classe de compostos de grande interesse científico devido às suas propriedades químicas e ao extenso espectro de atividades biológicas. Neste trabalho, derivados tiazolidínicos e imidazolidínicos foram avaliados acerca da atividade antimicrobiana frente a bactérias e fungos. O caldo e o ágar Mueller-Hinton e Sabouraud foram usados para os testes e diluições seriadas dos compostos de concentrações variando entre 128μg/ml e 0,5μg/ml foram preparadas em Dimetilformamida(DMF). Os experimentos foram realizados em microplacas, incubadas em estufa bacteriológica, após as quais o conteúdo foi semeado em placas de Petri, contendo meio sólido, para análise da presença ou ausência de crescimento, sendo considerada a Concentração Inibitória Mínima(CIM) a menor concentração da droga para a qual não havia presença de colônias. Foi verificada atividade antimicrobiana frente a todos os compostos, estando o melhor resultado de CIM igual a 32μg/mL. O derivado imidazolidínico NN-41 foi utilizado para avaliação do efeito sinérgico, quando combinado com o antibiótico ampicilina sobre a bactéria Escherichia coli resistente (ATCC 35218). O teste de difusão em meio sólido, após a ação sinérgica, mostrou halo de inibição de 20mm, enquanto a ampicilina isolada mostrou halo 14mm, demonstrando que a combinação resultou em maior ação antibacteriana. A mesma bactéria foi avaliada, via microscopia eletrônica de transmissão acerca das alterações estruturais, após o tratamento com o composto NN-41, sendo observado alterações na morfologia da parede celular, formação de vacúolos e edemas intracelulares. Os resultados sugerem capacidade antimicrobiana dos novos derivados tiazolidínicos e imidazolidínicos utilizados, inclusive com potencial de utilização frente a uma bactéria Gram negativa multirresistente da espécie Escherichia coli de grande interesse clínico

O gênero Streptomyces é conhecido por produzir uma ampla variedade de moléculas bioativas como antimicrobianos, enzimas, agentes antitumorais, antivirais, promotores de crescimento, entre outros. Pesquisas com este grupo de microrganismos têm sido realizadas há mais de 60 anos, no entanto, estudos recentes demonstram que este grupo representa uma fonte inesgotável de novas moléculas bioativas. Neste trabalho, foi avaliada a atividade antimicrobiana de 25 isolados de Streptomyces. Para tanto foram empregados 53 microgansimos teste, incluindo bactérias Gram positivas, Gram negativas, leveduras e fungos filamentosos. A atividade antimicrobiana foi determinada pela técnica da dupla camada. Os isolados que apresentaram melhor atividade antimicrobiana foram cultivados em cultura submersa, sob diferentes condições de cultivo (meio de cultivo, tempo e temperatura). Dos 25 isolados 80 % apresentaram atividade antimicrobiana, destes 80% apresentaram atividade antibacteriana e 45% atividade antifúngica. Dos isolados que apresentaram atividade antimicrobiana 40% apresentaram um amplo espectro, inibiram mais de dez microrganismos teste. Duas linhagens identificadas como Streptomyces sp 1S e Streptomyces sp. 50 foram selecioandos para estudos de produção e caracterização. Streptomyces 1S inibiu 46 microrganismos teste e o isolado 50 foi ativo especialmente contra Enterococcus multiresistentes. A caracterização morfológica, bioquímica e a análise da seqüência parcial da região 16S do rDNA, demonstram a grande diversidade deste grupo de microrganismos e auxiliaram na identificação em nível de gênero. As melhores condições para a produção de metabólitos bioactivos, bem como a caracterização destes isolados são reportados no presente estudo. Foi observado que as condições ambientais e do substrato são fundamentais na produção de metabólitos secundários especialmente antimicrobianos. / Streptomyces genus are well- know due to its high capacity to produce innumerous bioactive metabolites such as, enzymes, antitumour agents, immunomodifying agents, vitamins, growth promoters, and antibiotic compounds among others. Research with this group of microorganisms has been realized since de sixties. However, more recent research has shown that this group still is a very important resource of new secondary metabolites, especially antibiotics. In this work the antimicrobial activity of 25 Streptomyces strain, was evaluated against 53 test microorganisms including Gram positive and negative bacteria, filamentous fungi and yeasts with clinical and agricultural interest. The antimicrobial activity in the first screening was realized using the double layer method. The strains that showed potential results in the first screening were grown on submerge culture in different growth conditions of temperature, culture media and time of growth. From the 25 Streptomyces isolates tested 80% showed antimicrobial activity, out of that 80% presented antibacterial activity and 45% antifungal activity. Out, from the isolates that showed antibacterial activity 40% presented a wide spectrum of activity, inhibiting more than 10 microorganisms. Two strains were selected for further studies, Streptomyces sp. 1S and Strepomyces sp. 50. Isolate 1S was chosen because it was able, in the antimicrobial screening, to inhibit 46 test microorganisms. Isolate 50 showed especial activities against multiresistent Enterococcus sp. This two isolates were submitted to morphological and biochemical characterization and the analysis of partial 16S rDNA sequence was done. The results confirmed the high diversity of this genus, and with the results obtained only the genus was possible to be confirmed. The best growth conditions for metabolites production and the characterization of the isolates are described in this work. It has been observed that the environmental conditions are extremely important for the production of secondary metabolites, especially antibiotics.

Bacillus cereus 8A, isolado de solo da região sul do Brasil, produz uma bacteriocina, cereína 8A, que apresenta potencial para utilização como bioconservante no controle de microrganismos patogênicos e deteriorantes de alimentos. Neste trabalho foram realizados estudos de caracterização e otimização no processo de obtenção da cereína semi-purificada. Na primeira etapa do trabalho foi estudada a cinética de inativação térmica para a cereína 8A. Amostras da bacteriocina foram tratadas em diferentes combinações de tempo/temperatura no intervalo de 0-30min. e 70-82°C e os parâmetros termodinâmicos e cinéticos para a inativação da cereína 8A foram calculados. Os resultados revelaram que a inativação segue uma reação de primeira ordem com valores de k entre 0.059 e 0.235 min-1. A diminuição e o aumento dos valores de D e k, respectivamente, com o aumento da temperatura, indicaram uma rápida inativação de bacteriocina a temperaturas mais elevadas. Os resultados sugerem que a cereína 8A é uma bacteriocina relativamente termoestável com um valor de z de 21.98ºC e energia de ativação de 105.7 kJ mol-1. Em um segundo momento, a capacidade dos quelantes EDTA e lactato de sódio em diferentes concentrações e da cereína 8A (3200 UA/ml-1) em inibir e inativar a Salmonella Enteritidis foram analisadas. Os resultados indicaram que todos os tratamentos testados, EDTA, lactato de sódio e cereína 8A, sozinhos e em combinação, causaram uma redução significativa nos valores de OD600 em culturas de S. Enteritidis. A combinação de cerein 8A acrescido EDTA 100 mol l-1 resultou em um tratamento mais eficaz para reduzir o número de células viáveis de S. enteritidis. A microscopia de eletrônica de transmissão revelou paredes de células danificadas e perda de materiais protoplasmáticos nas células tratadas. As células de S. enteritidis tratadas com 8A cereína sozinha mostraram pequenos poros e o tratamento não afetou a maioria das células. Quando o agente quelante EDTA foi adicionado, as células mostraram-se mais danificadas. As lesões na parede celular tornaram-se mais intensas com a combinação de cereína 8A acrescida de EDTA, inclusive demonstrando uma notável perda do material intracelular, como observado nos resultados dos tratamentos com EDTA 50 e 100 mmol l-1 mais cereína 8A. A última etapa deste estudo investigou o particionamento da cereína 8A em dois sistemas de extração líquido-líquido, um com Triton X-114 e outro PEG com sais inorgânicos, que são considerados promissores para fins de bioseparação e depuração. Os resultados indicaram que cereína 8A particiona preferencialmente na fase rica em micela no sistema com Triton X-114 na concentração de 4 % e sua atividade antimicrobiana foi preservado. Em ATPS, os melhores resultados foram relativos ao coeficiente de partição obtidos com PEG e sulfato de amônio, quando o cloreto de sódio foi adicionado, o valor do Kb aumentou significativamente e mostrou o melhor rendimento de recuperação quando comparado com o sistema micelar. A purificação convencional resulta em um fator de purificação superior, mas em uma recuperação menor em comparação com métodos de particionamento. Estes resultados representam um importante passo no sentido de desenvolver um método de separação para cereína 8A e de um modo mais geral, para outras biomoléculas de interesse. / The bacteriocin cerein 8A, produced by a strain of B. cereus 8A, isolated from soil of south of Brazil with potential application against food spoilage and pathogenic bacteria.At the first phase of the study, the kinetics of thermal inactivation was studied for the bacteriocin cerein 8A. Samples of cerein 8A were treated at different time-temperature combinations in the range of 0-30 min and 70-82°C and the thermodynamic and kinetic parameters for bacteriocin inactivation were calculated. Results showed that inactivation followed a first-order reaction with k-values between 0.059 and 0.235 min-1. D- and k-values decreased and increased, respectively, with increasing temperature, indicating a faster bacteriocin inactivation at higher temperatures. Results suggest that cerein 8A is a relatively thermostable bacteriocin with a z-value of 21.98 °C and Ea of 105.7 kJ mol-1. In a second time, the ability of chelators EDTA and sodium lactate on different concentrations and cerein 8A (3200 UA/ml-1) to inhibit and inactivate Salmonella Enteritidis was investigated. The results indicated that all treatments tested, namely EDTA, sodium lactate and cerein 8A, alone and in combination, caused a significant reduction in the OD600 values of S. Enteritidis cultures. The addition of bacteriocin plus EDTA resulted in higher inhibition in comparison with the bacteriocin alone; the greater the concentration of EDTA, the greater the inhibitory effect. Transmission electron microscopy showed damaged cell walls and loss of protoplasmic material in treated cells. The cells of S. Enteritidis treated with cerein 8A alone showed small pores and the treatment does not affect the majority of cells. When the chelating agent EDTA was added the cells appeared more damaged. The injuries in cell wall become more marked with the combination of EDTA plus cerein 8A, including noticeable discharge of intracellular material, as shown for treatments with 50 and 100 mmol l- 1EDTA plus cerein 8A. The last step of this study investigated the partitioning of cerein 8A in two liquid–liquid extraction systems that are considered promising for bioseparation and purification purposes. In aqueous two phase micellar systems Triton X-114 was chosen as the as phase-forming surfactant. Aqueous two-phase systems were prepared of PEG and inorganic salts and the addition of sodium chloride was investigated in this system. Results indicated that cerein 8A partitions preferentially to the micelle rich-phase in the system with 4% Triton X-114 concentration and its antimicrobial activity was preserved. In ATPS, the best results concerning to the partition coefficients (Kb) were obtained with PEG + ammonium sulphate, when sodium chloride was added the value of Kb increase significantly and showed the best recovery yield when compared with micellar systems. The conventional purification results a higher purification fold, but a minor recovery in comparison with partitioning methods. The successful implementation of this peptide partitioning, from a suspension containing other compounds, represents an important step towards developing a separation method for cerein 8A, and more generally, for other biomolecules of interest.

O gênero Streptomyces é conhecido por produzir uma ampla variedade de moléculas bioativas como antimicrobianos, enzimas, agentes antitumorais, antivirais, promotores de crescimento, entre outros. Pesquisas com este grupo de microrganismos têm sido realizadas há mais de 60 anos, no entanto, estudos recentes demonstram que este grupo representa uma fonte inesgotável de novas moléculas bioativas. Neste trabalho, foi avaliada a atividade antimicrobiana de 25 isolados de Streptomyces. Para tanto foram empregados 53 microgansimos teste, incluindo bactérias Gram positivas, Gram negativas, leveduras e fungos filamentosos. A atividade antimicrobiana foi determinada pela técnica da dupla camada. Os isolados que apresentaram melhor atividade antimicrobiana foram cultivados em cultura submersa, sob diferentes condições de cultivo (meio de cultivo, tempo e temperatura). Dos 25 isolados 80 % apresentaram atividade antimicrobiana, destes 80% apresentaram atividade antibacteriana e 45% atividade antifúngica. Dos isolados que apresentaram atividade antimicrobiana 40% apresentaram um amplo espectro, inibiram mais de dez microrganismos teste. Duas linhagens identificadas como Streptomyces sp 1S e Streptomyces sp. 50 foram selecioandos para estudos de produção e caracterização. Streptomyces 1S inibiu 46 microrganismos teste e o isolado 50 foi ativo especialmente contra Enterococcus multiresistentes. A caracterização morfológica, bioquímica e a análise da seqüência parcial da região 16S do rDNA, demonstram a grande diversidade deste grupo de microrganismos e auxiliaram na identificação em nível de gênero. As melhores condições para a produção de metabólitos bioactivos, bem como a caracterização destes isolados são reportados no presente estudo. Foi observado que as condições ambientais e do substrato são fundamentais na produção de metabólitos secundários especialmente antimicrobianos. / Streptomyces genus are well- know due to its high capacity to produce innumerous bioactive metabolites such as, enzymes, antitumour agents, immunomodifying agents, vitamins, growth promoters, and antibiotic compounds among others. Research with this group of microorganisms has been realized since de sixties. However, more recent research has shown that this group still is a very important resource of new secondary metabolites, especially antibiotics. In this work the antimicrobial activity of 25 Streptomyces strain, was evaluated against 53 test microorganisms including Gram positive and negative bacteria, filamentous fungi and yeasts with clinical and agricultural interest. The antimicrobial activity in the first screening was realized using the double layer method. The strains that showed potential results in the first screening were grown on submerge culture in different growth conditions of temperature, culture media and time of growth. From the 25 Streptomyces isolates tested 80% showed antimicrobial activity, out of that 80% presented antibacterial activity and 45% antifungal activity. Out, from the isolates that showed antibacterial activity 40% presented a wide spectrum of activity, inhibiting more than 10 microorganisms. Two strains were selected for further studies, Streptomyces sp. 1S and Strepomyces sp. 50. Isolate 1S was chosen because it was able, in the antimicrobial screening, to inhibit 46 test microorganisms. Isolate 50 showed especial activities against multiresistent Enterococcus sp. This two isolates were submitted to morphological and biochemical characterization and the analysis of partial 16S rDNA sequence was done. The results confirmed the high diversity of this genus, and with the results obtained only the genus was possible to be confirmed. The best growth conditions for metabolites production and the characterization of the isolates are described in this work. It has been observed that the environmental conditions are extremely important for the production of secondary metabolites, especially antibiotics.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-02-06T18:02:48Z No. of bitstreams: 1 2016_MarceloHenriqueSollerRamada_Parcial.pdf: 502741 bytes, checksum: 8fdcc3f44e414400d15a1a4a32e63254 (MD5) / Approved for entry into archive by Ruthléa Nascimento(ruthleanascimento@bce.unb.br) on 2017-03-16T14:34:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_MarceloHenriqueSollerRamada_Parcial.pdf: 502741 bytes, checksum: 8fdcc3f44e414400d15a1a4a32e63254 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-16T14:34:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_MarceloHenriqueSollerRamada_Parcial.pdf: 502741 bytes, checksum: 8fdcc3f44e414400d15a1a4a32e63254 (MD5) / Há um número crescente de evidências demonstrando que a proteólise em matrizes biológicas pode gerar vários peptídeos bioativos de várias proteínas. Esses peptídeos, quando liberados, podem apresentar atividades diferentes daquela da proteína parental. Ex.: Atividades hipotensoras, opióides e antimicrobianas. Entretanto, vários outros peptídeos podem estar presos dentro de uma sequência polipeptídica, sem sítios de clivagem enzimática evidentes para sua liberação. Um recente aprofundamento na informação genômica de diferentes espécies demonstrou que há diversos peptídeos antimicrobianos encriptados em sequências proteicas maiores, evidenciando uma potencialidade pouco explorada. Nesta tese, abordamos a exploração desse potencial encriptado no genoma de plantas de interesse como Theobroma cacao, Arabidopsis thaliana, Citrus sinensis e Gossypium raimondii. Os possíveis peptídeos antimicrobianos intragênicos (PAIs), de cada uma das plantas de interesse, foram filtrados através do programa Kamal, utilizando diferentes parâmetros físico-químicos. No total, 21 PAIs foram selecionados, sintetizados quimicamente e avaliados quanto ao seu potencial de inibir o crescimento de fungos, leveduras e bactérias, patógenos de plantas ou humanos. Dezesseis PAIs inibiram, pelo menos, um dos microrganismos testados, alguns com atividades similares ou superiores aos peptídeos antimicrobianos (AMPs) DS01 e Asc-8. De quatro peptídeos testados, dois apresentaram sinergismo com antibióticos comerciais na inibição do crescimento de biofilmes de Candida albicans. Análises biofísicas também foram realizadas para melhor entender as propriedades dos peptídeos gerados. A estrutura secundária dos 21 PAIs e de outros 6 AMPs sintetizados foi avaliada na presença e ausência de vesículas modelo de fosfolipídios. O efeito que esses peptídeos causam na transição de fase das vesículas fosfolipídica também foi avaliado. Uma análise de componentes principais permitiu a categorização dos peptídeos em quatro grupos diferentes. Tal análise permitiu evidenciar a importância da hidrofobicidade e da possível formação de hélice na atividade dos peptídeos. Tais resultados permitiram um novo entendimento e evolução do nosso sistema de predição de moléculas antimicrobianas, que pode ser aplicar na busca de novos PAIs. A reinserção da informação do(s) PAI(s) nos respectivos genomas na tentativa de controlar doenças causadas por microrganismos, é uma perspectiva promissora para o futuro próximo. Também podemos destacar como perspectiva, estudos mais profundos contra patógenos humanos, na busca por novos antibióticos ou potencializadores dos atuais. / There is an increasing number of evidences demonstrating that physiological proteolysis can yield many bioactive peptides encrypted in various proteins. These peptides, once released, may show different biological activities than their respective parent-protein e.g. hypotensive, opioid and antimicrobial actions. However, other bioactive peptides may be stuck on a polypeptide chain with no evident proteolytic cleavage sites for its release. A recent survey in the genomic information of different species showed that there are many encrypted antimicrobial peptides in larger protein sequences highlighting an unexplored potential. In this thesis, we explored this encrypted potential in the genomes of plants such as Theobroma cacao, Arabidopsis thaliana, Citrus sinensis e Gossypium raimondii. The putative intragenic antimicrobial peptides (IAPs) of each plant were filtered using different physical-chemical parameters via Kamal software. A total of 21 IAPs were selected, chemically synthesized and tested for their potential to inhibit the growth of human and plant fungi, yeasts and bacteria. Sixteen IAPs inhibit, at least, one of the tested microorganisms showing similar or superior activities when compared to the antimicrobial peptides (AMPs) DS01 e Asc-8. Two out of four peptides tested for their potential to act in synergy with commercial antibiotics were able to enhance the inhibition on Candida albicans biofilm formation. Biophysical analysis of the IAPs were performed to increase our knowledge about the peptides properties. The secondary structure of 21 IAPs and 6 AMPs were evaluated in the presence or absence of model phospholipid vesicles. The effect that these peptides have on the main phase transition of this phospholipid vesicles was also evaluated. A principal component analysis of the biophysical data clustered the peptides in four different groups. This analysis also highlighted the importance of hydrophobicity and propensity to helix formation in the activity of the IAPs. The results herein allowed a new understanding and evolution on our antimicrobial molecule prediction system that can be used in the search for new IAPs. The reinsertion of the IAPs information in its respective genome as an attempt to control infections caused by microorganisms is a promising perspective for the near future, as well as a deeper study with human pathogens in the search for new antibiotics or enhancers for the commercial ones.