Uma bacteriocina produzida por um microrganismo isolado do intestino do peixe Jaraqui, da bacia Amazônica, foi caracterizada. A bactéria foi identificada como pertencente ao gênero Bacillus por testes citomorfológicos, bioquímicos e fisiológicos. A análise filogenética feita através da seqüência do rDNA 16S revelou que a bactéria é geneticamente próxima de bactérias como B. subtilis e B. amyloliquefaciens. A bacteriocina foi produzida no início da fase exponencial de crescimento e a sua concentração atingiu o nível máximo no início da fase estacionária, caracterizando-se como metabólito primário. O sobrenadante inibiu Staphylococcus aureus, Salmonella Gallinarium, Listeria monocytogenes, Erwinia caratorvora entre outras espécies patogênicas. A atividade manteve-se constante em temperaturas de 10 a 100 ºC, por 30 minutos, iniciando um declínio a 100 ºC por 40 minutos. No teste do efeito de enzimas proteolíticas, a pronase E causou a perda do efeito antimicrobiano, indicando que se trata de uma substância de natureza protéica. A purificação foi realizada inicialmente por precipitação com sulfato de amônio, seguida de uma cromatografia de gel filtração (Sephadex G- 100). A etapa final foi a cromatografia de troca iônica (DEAE Sepharose). No final deste processo, obteve-se um fator de purificação de 42,6 com uma recuperação de 6,75%. A bacteriocina purificada manteve sua estabilidade térmica, mas perdeu a estabilidade frente a enzimas proteolíticas. O espectro de infravermelho indicou grupamentos NH e ligações peptídicas e o espectro de massas indicou um peptídeo de 1518,554 Da. A bacteriocina parcialmente purificada tem um EC50 de 400UA/mL e provocou uma diminuição de 6 logs de células de Listeria monocytogenes com 800UA/mL, provavelmente provocando lise celular. / A bacteriocin produced by a microrganism isolated from the intestine of the fish Jaraqui of the Amazonian basin was characterized. The bacterium was identified as a species of the Bacillus genus by cytomorphological, biochemical and physiological tests. The phylogenetical analysis done by 16S rDNA sequence revealed that the bacterium is genetically close to B. subtilis and B. amyloliquefaciens. The bacteriocin is produced at exponential growth phase and its concentration achieves the maximum level at stationary growth phase, suggesting that this compound is a primary metabolite. The culture supernatant was active against Staphylococcus aureus, Salmonella Gallinarium, Listeria monocytogenes, Erwinia caratorvora among other pathogenic species. The activity was constant in temperatures from 10 to 100 ºC for 30 minutes, begining to decline at 100 ºC for 40 minutos. When treated with proteolitic enzymes, pronase E caused the lost of the antimicrobian efect, proving that is a substance of proteinaceous nature. The purification was developed by ammoniun sulfate precipitation, followed by gel filtration chromatography (Sephadex G-100). The last step was an ion exchange chromatography (DEAE Sepharose). By the end of this process, we have a purification factor of 42,6 and a yield of 6,75%. The purified bacteriocin keeps its thermal stability, but looses the stability towards proteolytic enzymes. The infrared spectrum indicates NH groups and peptidic bounds and the mass spectrum indicates a peptide of 1518,554 Da. The bacteriocin partially purified has a EC50 of 400UA/mL and kills all viable cells of Listeria monocytogenes with 800UA/mL, probably by cell lysis.

Uma bacteriocina produzida por um microrganismo isolado do intestino do peixe Jaraqui, da bacia Amazônica, foi caracterizada. A bactéria foi identificada como pertencente ao gênero Bacillus por testes citomorfológicos, bioquímicos e fisiológicos. A análise filogenética feita através da seqüência do rDNA 16S revelou que a bactéria é geneticamente próxima de bactérias como B. subtilis e B. amyloliquefaciens. A bacteriocina foi produzida no início da fase exponencial de crescimento e a sua concentração atingiu o nível máximo no início da fase estacionária, caracterizando-se como metabólito primário. O sobrenadante inibiu Staphylococcus aureus, Salmonella Gallinarium, Listeria monocytogenes, Erwinia caratorvora entre outras espécies patogênicas. A atividade manteve-se constante em temperaturas de 10 a 100 ºC, por 30 minutos, iniciando um declínio a 100 ºC por 40 minutos. No teste do efeito de enzimas proteolíticas, a pronase E causou a perda do efeito antimicrobiano, indicando que se trata de uma substância de natureza protéica. A purificação foi realizada inicialmente por precipitação com sulfato de amônio, seguida de uma cromatografia de gel filtração (Sephadex G- 100). A etapa final foi a cromatografia de troca iônica (DEAE Sepharose). No final deste processo, obteve-se um fator de purificação de 42,6 com uma recuperação de 6,75%. A bacteriocina purificada manteve sua estabilidade térmica, mas perdeu a estabilidade frente a enzimas proteolíticas. O espectro de infravermelho indicou grupamentos NH e ligações peptídicas e o espectro de massas indicou um peptídeo de 1518,554 Da. A bacteriocina parcialmente purificada tem um EC50 de 400UA/mL e provocou uma diminuição de 6 logs de células de Listeria monocytogenes com 800UA/mL, provavelmente provocando lise celular. / A bacteriocin produced by a microrganism isolated from the intestine of the fish Jaraqui of the Amazonian basin was characterized. The bacterium was identified as a species of the Bacillus genus by cytomorphological, biochemical and physiological tests. The phylogenetical analysis done by 16S rDNA sequence revealed that the bacterium is genetically close to B. subtilis and B. amyloliquefaciens. The bacteriocin is produced at exponential growth phase and its concentration achieves the maximum level at stationary growth phase, suggesting that this compound is a primary metabolite. The culture supernatant was active against Staphylococcus aureus, Salmonella Gallinarium, Listeria monocytogenes, Erwinia caratorvora among other pathogenic species. The activity was constant in temperatures from 10 to 100 ºC for 30 minutes, begining to decline at 100 ºC for 40 minutos. When treated with proteolitic enzymes, pronase E caused the lost of the antimicrobian efect, proving that is a substance of proteinaceous nature. The purification was developed by ammoniun sulfate precipitation, followed by gel filtration chromatography (Sephadex G-100). The last step was an ion exchange chromatography (DEAE Sepharose). By the end of this process, we have a purification factor of 42,6 and a yield of 6,75%. The purified bacteriocin keeps its thermal stability, but looses the stability towards proteolytic enzymes. The infrared spectrum indicates NH groups and peptidic bounds and the mass spectrum indicates a peptide of 1518,554 Da. The bacteriocin partially purified has a EC50 of 400UA/mL and kills all viable cells of Listeria monocytogenes with 800UA/mL, probably by cell lysis.

Bacteriocinas são peptídeos com atividade bactericida ou bacteriostática para espécies sensíveis ao produto bacteriano. Estas substâncias são compostos heterogêneos em relação à massa molecular, propriedades bioquímicas, espectro inibitório e mecanismos de ação. Apesar dos trabalhos realizados quanto à biodiversidade da Amazônia, poucos estudos são desenvolvidos com o objetivo de investigar a complexidade genética e o potencial biotecnológico desta região, principalmente quando se trata de micro-organismos. Neste âmbito, o presente trabalho teve como objetivo verificar a presença de genes de bacteriocinas produzidas por diferentes linhagens de Bacillus isoladas de intestino de peixes da Região Amazônica, Brasil. Os PCRs mostraram que as cinco linhagens testadas apresentam o gene funcional codificante de malonil Coa transacilase (ituD), para o gene codificador da pré-subtilosina A (sboA) e para o gene codificador da pré-subtilina (spaS). Quatro isolados possuem também o suposto gene terminador transcricional (sfp). A inibição do crescimento de fungos fitopatogênicos caracterizou a atividade antimicótica dos isolados. A caracterização da atividade biossurfactante foi realizada pela presença de zonas de hemólise ao redor de cada colônia e atividade emulsificante. Análises realizadas por MALDI-TOF confirmam a produção de surfactina, iturina A, subtilina, subtilosina A e isoformas. Ao comparar as linhagens de Bacillus Amazônicos com Bacillus subtilis ATCC 19659 em relação ao nível de expressão de sboA e ituD, observou-se, de forma geral, um nível de expressão de sboA pelos isolados Amazônicos inferior a B. subtillis ATCC 19659. Em contraste, quando os níveis de ituD foram avaliados, percebeu-se que as linhagens Amazônicas exibiram altos níveis de expressão deste gene. Acredita-se que independente do controle regulatório a que estão subordinados os operons de iturina A e subtilosina A nas condições de estresse utilizadas por este estudo, os isolados de Bacillus possuem um nível basal de expressão diferenciado entre si e em relação à B. subtilis ATCC 19659. / Bacteriocins are peptides with bactericidal or bacteriostatic activity for species closely related to bacterial product. These substances are heterogeneous compounds in relation to molecular weight, biochemical properties, inhibitory spectrum and mechanisms of action. Despite the work done on the biodiversity of the Amazon, few studies were developed with the objective of investigating the genetic complexity and biotechnology potential in this region, especially when it comes to microorganisms. In this context, this study aimed to verify the presence of genes of bacteriocins produced by five strains of Bacillus isolated from aquatic environment of the Amazon region, Brazil. The PCRs showed that strains tested exhibit potential for the functional gene encoding for malonyl CoA transacilase (ituD), for the gene encoding prosubtilosin A (sboA), and the gene encoding prosubtilin (spaS). Four isolates also have potential for the putative transcriptional terminator gene (sfp). Inhibiting the growth of pathogenic fungi characterizes the antimycotic activity of the isolates. The characterization of biosurfactant activity is undertaken by the presence of zones of hemolysis around each colony, as well the emulsifying activity. Analyses carried out by MALDI-TOF mass spectrometry confirmed the production of surfactin, iturin A subtilin, subtilosin A and isoforms. By comparing Bacillus strains isolated from the Amazon region with Bacillus subtilis ATCC 19659 on the level of sboA and ituD expression, there was, overall, a level of sboA expression of the isolated Amazonian less than B. subtilis ATCC 19659. In contrast, when levels of ituD were evaluated, it was noticed that the Amazonian strains exhibited high levels of expression of this gene. It is believed that regardless of regulatory control that are the subject of iturin A and subtilosin A operons in stress conditions used in this study, isolates of Bacillus have a baseline level of expression is different among themselves and in relation to B. subtilis ATCC 19659.

Bacteriocinas são peptídeos com atividade bactericida ou bacteriostática para espécies sensíveis ao produto bacteriano. Estas substâncias são compostos heterogêneos em relação à massa molecular, propriedades bioquímicas, espectro inibitório e mecanismos de ação. Apesar dos trabalhos realizados quanto à biodiversidade da Amazônia, poucos estudos são desenvolvidos com o objetivo de investigar a complexidade genética e o potencial biotecnológico desta região, principalmente quando se trata de micro-organismos. Neste âmbito, o presente trabalho teve como objetivo verificar a presença de genes de bacteriocinas produzidas por diferentes linhagens de Bacillus isoladas de intestino de peixes da Região Amazônica, Brasil. Os PCRs mostraram que as cinco linhagens testadas apresentam o gene funcional codificante de malonil Coa transacilase (ituD), para o gene codificador da pré-subtilosina A (sboA) e para o gene codificador da pré-subtilina (spaS). Quatro isolados possuem também o suposto gene terminador transcricional (sfp). A inibição do crescimento de fungos fitopatogênicos caracterizou a atividade antimicótica dos isolados. A caracterização da atividade biossurfactante foi realizada pela presença de zonas de hemólise ao redor de cada colônia e atividade emulsificante. Análises realizadas por MALDI-TOF confirmam a produção de surfactina, iturina A, subtilina, subtilosina A e isoformas. Ao comparar as linhagens de Bacillus Amazônicos com Bacillus subtilis ATCC 19659 em relação ao nível de expressão de sboA e ituD, observou-se, de forma geral, um nível de expressão de sboA pelos isolados Amazônicos inferior a B. subtillis ATCC 19659. Em contraste, quando os níveis de ituD foram avaliados, percebeu-se que as linhagens Amazônicas exibiram altos níveis de expressão deste gene. Acredita-se que independente do controle regulatório a que estão subordinados os operons de iturina A e subtilosina A nas condições de estresse utilizadas por este estudo, os isolados de Bacillus possuem um nível basal de expressão diferenciado entre si e em relação à B. subtilis ATCC 19659. / Bacteriocins are peptides with bactericidal or bacteriostatic activity for species closely related to bacterial product. These substances are heterogeneous compounds in relation to molecular weight, biochemical properties, inhibitory spectrum and mechanisms of action. Despite the work done on the biodiversity of the Amazon, few studies were developed with the objective of investigating the genetic complexity and biotechnology potential in this region, especially when it comes to microorganisms. In this context, this study aimed to verify the presence of genes of bacteriocins produced by five strains of Bacillus isolated from aquatic environment of the Amazon region, Brazil. The PCRs showed that strains tested exhibit potential for the functional gene encoding for malonyl CoA transacilase (ituD), for the gene encoding prosubtilosin A (sboA), and the gene encoding prosubtilin (spaS). Four isolates also have potential for the putative transcriptional terminator gene (sfp). Inhibiting the growth of pathogenic fungi characterizes the antimycotic activity of the isolates. The characterization of biosurfactant activity is undertaken by the presence of zones of hemolysis around each colony, as well the emulsifying activity. Analyses carried out by MALDI-TOF mass spectrometry confirmed the production of surfactin, iturin A subtilin, subtilosin A and isoforms. By comparing Bacillus strains isolated from the Amazon region with Bacillus subtilis ATCC 19659 on the level of sboA and ituD expression, there was, overall, a level of sboA expression of the isolated Amazonian less than B. subtilis ATCC 19659. In contrast, when levels of ituD were evaluated, it was noticed that the Amazonian strains exhibited high levels of expression of this gene. It is believed that regardless of regulatory control that are the subject of iturin A and subtilosin A operons in stress conditions used in this study, isolates of Bacillus have a baseline level of expression is different among themselves and in relation to B. subtilis ATCC 19659.

Bacteriocinas são peptídeos com atividade bactericida ou bacteriostática para espécies sensíveis ao produto bacteriano. Estas substâncias são compostos heterogêneos em relação à massa molecular, propriedades bioquímicas, espectro inibitório e mecanismos de ação. Apesar dos trabalhos realizados quanto à biodiversidade da Amazônia, poucos estudos são desenvolvidos com o objetivo de investigar a complexidade genética e o potencial biotecnológico desta região, principalmente quando se trata de micro-organismos. Neste âmbito, o presente trabalho teve como objetivo verificar a presença de genes de bacteriocinas produzidas por diferentes linhagens de Bacillus isoladas de intestino de peixes da Região Amazônica, Brasil. Os PCRs mostraram que as cinco linhagens testadas apresentam o gene funcional codificante de malonil Coa transacilase (ituD), para o gene codificador da pré-subtilosina A (sboA) e para o gene codificador da pré-subtilina (spaS). Quatro isolados possuem também o suposto gene terminador transcricional (sfp). A inibição do crescimento de fungos fitopatogênicos caracterizou a atividade antimicótica dos isolados. A caracterização da atividade biossurfactante foi realizada pela presença de zonas de hemólise ao redor de cada colônia e atividade emulsificante. Análises realizadas por MALDI-TOF confirmam a produção de surfactina, iturina A, subtilina, subtilosina A e isoformas. Ao comparar as linhagens de Bacillus Amazônicos com Bacillus subtilis ATCC 19659 em relação ao nível de expressão de sboA e ituD, observou-se, de forma geral, um nível de expressão de sboA pelos isolados Amazônicos inferior a B. subtillis ATCC 19659. Em contraste, quando os níveis de ituD foram avaliados, percebeu-se que as linhagens Amazônicas exibiram altos níveis de expressão deste gene. Acredita-se que independente do controle regulatório a que estão subordinados os operons de iturina A e subtilosina A nas condições de estresse utilizadas por este estudo, os isolados de Bacillus possuem um nível basal de expressão diferenciado entre si e em relação à B. subtilis ATCC 19659. / Bacteriocins are peptides with bactericidal or bacteriostatic activity for species closely related to bacterial product. These substances are heterogeneous compounds in relation to molecular weight, biochemical properties, inhibitory spectrum and mechanisms of action. Despite the work done on the biodiversity of the Amazon, few studies were developed with the objective of investigating the genetic complexity and biotechnology potential in this region, especially when it comes to microorganisms. In this context, this study aimed to verify the presence of genes of bacteriocins produced by five strains of Bacillus isolated from aquatic environment of the Amazon region, Brazil. The PCRs showed that strains tested exhibit potential for the functional gene encoding for malonyl CoA transacilase (ituD), for the gene encoding prosubtilosin A (sboA), and the gene encoding prosubtilin (spaS). Four isolates also have potential for the putative transcriptional terminator gene (sfp). Inhibiting the growth of pathogenic fungi characterizes the antimycotic activity of the isolates. The characterization of biosurfactant activity is undertaken by the presence of zones of hemolysis around each colony, as well the emulsifying activity. Analyses carried out by MALDI-TOF mass spectrometry confirmed the production of surfactin, iturin A subtilin, subtilosin A and isoforms. By comparing Bacillus strains isolated from the Amazon region with Bacillus subtilis ATCC 19659 on the level of sboA and ituD expression, there was, overall, a level of sboA expression of the isolated Amazonian less than B. subtilis ATCC 19659. In contrast, when levels of ituD were evaluated, it was noticed that the Amazonian strains exhibited high levels of expression of this gene. It is believed that regardless of regulatory control that are the subject of iturin A and subtilosin A operons in stress conditions used in this study, isolates of Bacillus have a baseline level of expression is different among themselves and in relation to B. subtilis ATCC 19659.

Uma bacteriocina produzida por um microrganismo isolado do intestino do peixe Jaraqui, da bacia Amazônica, foi caracterizada. A bactéria foi identificada como pertencente ao gênero Bacillus por testes citomorfológicos, bioquímicos e fisiológicos. A análise filogenética feita através da seqüência do rDNA 16S revelou que a bactéria é geneticamente próxima de bactérias como B. subtilis e B. amyloliquefaciens. A bacteriocina foi produzida no início da fase exponencial de crescimento e a sua concentração atingiu o nível máximo no início da fase estacionária, caracterizando-se como metabólito primário. O sobrenadante inibiu Staphylococcus aureus, Salmonella Gallinarium, Listeria monocytogenes, Erwinia caratorvora entre outras espécies patogênicas. A atividade manteve-se constante em temperaturas de 10 a 100 ºC, por 30 minutos, iniciando um declínio a 100 ºC por 40 minutos. No teste do efeito de enzimas proteolíticas, a pronase E causou a perda do efeito antimicrobiano, indicando que se trata de uma substância de natureza protéica. A purificação foi realizada inicialmente por precipitação com sulfato de amônio, seguida de uma cromatografia de gel filtração (Sephadex G- 100). A etapa final foi a cromatografia de troca iônica (DEAE Sepharose). No final deste processo, obteve-se um fator de purificação de 42,6 com uma recuperação de 6,75%. A bacteriocina purificada manteve sua estabilidade térmica, mas perdeu a estabilidade frente a enzimas proteolíticas. O espectro de infravermelho indicou grupamentos NH e ligações peptídicas e o espectro de massas indicou um peptídeo de 1518,554 Da. A bacteriocina parcialmente purificada tem um EC50 de 400UA/mL e provocou uma diminuição de 6 logs de células de Listeria monocytogenes com 800UA/mL, provavelmente provocando lise celular. / A bacteriocin produced by a microrganism isolated from the intestine of the fish Jaraqui of the Amazonian basin was characterized. The bacterium was identified as a species of the Bacillus genus by cytomorphological, biochemical and physiological tests. The phylogenetical analysis done by 16S rDNA sequence revealed that the bacterium is genetically close to B. subtilis and B. amyloliquefaciens. The bacteriocin is produced at exponential growth phase and its concentration achieves the maximum level at stationary growth phase, suggesting that this compound is a primary metabolite. The culture supernatant was active against Staphylococcus aureus, Salmonella Gallinarium, Listeria monocytogenes, Erwinia caratorvora among other pathogenic species. The activity was constant in temperatures from 10 to 100 ºC for 30 minutes, begining to decline at 100 ºC for 40 minutos. When treated with proteolitic enzymes, pronase E caused the lost of the antimicrobian efect, proving that is a substance of proteinaceous nature. The purification was developed by ammoniun sulfate precipitation, followed by gel filtration chromatography (Sephadex G-100). The last step was an ion exchange chromatography (DEAE Sepharose). By the end of this process, we have a purification factor of 42,6 and a yield of 6,75%. The purified bacteriocin keeps its thermal stability, but looses the stability towards proteolytic enzymes. The infrared spectrum indicates NH groups and peptidic bounds and the mass spectrum indicates a peptide of 1518,554 Da. The bacteriocin partially purified has a EC50 of 400UA/mL and kills all viable cells of Listeria monocytogenes with 800UA/mL, probably by cell lysis.

Bacillus cereus 8A, isolado de solo da região sul do Brasil, produz uma bacteriocina, cereína 8A, que apresenta potencial para utilização como bioconservante no controle de microrganismos patogênicos e deteriorantes de alimentos. Neste trabalho foram realizados estudos de caracterização e otimização no processo de obtenção da cereína semi-purificada. Na primeira etapa do trabalho foi estudada a cinética de inativação térmica para a cereína 8A. Amostras da bacteriocina foram tratadas em diferentes combinações de tempo/temperatura no intervalo de 0-30min. e 70-82°C e os parâmetros termodinâmicos e cinéticos para a inativação da cereína 8A foram calculados. Os resultados revelaram que a inativação segue uma reação de primeira ordem com valores de k entre 0.059 e 0.235 min-1. A diminuição e o aumento dos valores de D e k, respectivamente, com o aumento da temperatura, indicaram uma rápida inativação de bacteriocina a temperaturas mais elevadas. Os resultados sugerem que a cereína 8A é uma bacteriocina relativamente termoestável com um valor de z de 21.98ºC e energia de ativação de 105.7 kJ mol-1. Em um segundo momento, a capacidade dos quelantes EDTA e lactato de sódio em diferentes concentrações e da cereína 8A (3200 UA/ml-1) em inibir e inativar a Salmonella Enteritidis foram analisadas. Os resultados indicaram que todos os tratamentos testados, EDTA, lactato de sódio e cereína 8A, sozinhos e em combinação, causaram uma redução significativa nos valores de OD600 em culturas de S. Enteritidis. A combinação de cerein 8A acrescido EDTA 100 mol l-1 resultou em um tratamento mais eficaz para reduzir o número de células viáveis de S. enteritidis. A microscopia de eletrônica de transmissão revelou paredes de células danificadas e perda de materiais protoplasmáticos nas células tratadas. As células de S. enteritidis tratadas com 8A cereína sozinha mostraram pequenos poros e o tratamento não afetou a maioria das células. Quando o agente quelante EDTA foi adicionado, as células mostraram-se mais danificadas. As lesões na parede celular tornaram-se mais intensas com a combinação de cereína 8A acrescida de EDTA, inclusive demonstrando uma notável perda do material intracelular, como observado nos resultados dos tratamentos com EDTA 50 e 100 mmol l-1 mais cereína 8A. A última etapa deste estudo investigou o particionamento da cereína 8A em dois sistemas de extração líquido-líquido, um com Triton X-114 e outro PEG com sais inorgânicos, que são considerados promissores para fins de bioseparação e depuração. Os resultados indicaram que cereína 8A particiona preferencialmente na fase rica em micela no sistema com Triton X-114 na concentração de 4 % e sua atividade antimicrobiana foi preservado. Em ATPS, os melhores resultados foram relativos ao coeficiente de partição obtidos com PEG e sulfato de amônio, quando o cloreto de sódio foi adicionado, o valor do Kb aumentou significativamente e mostrou o melhor rendimento de recuperação quando comparado com o sistema micelar. A purificação convencional resulta em um fator de purificação superior, mas em uma recuperação menor em comparação com métodos de particionamento. Estes resultados representam um importante passo no sentido de desenvolver um método de separação para cereína 8A e de um modo mais geral, para outras biomoléculas de interesse. / The bacteriocin cerein 8A, produced by a strain of B. cereus 8A, isolated from soil of south of Brazil with potential application against food spoilage and pathogenic bacteria.At the first phase of the study, the kinetics of thermal inactivation was studied for the bacteriocin cerein 8A. Samples of cerein 8A were treated at different time-temperature combinations in the range of 0-30 min and 70-82°C and the thermodynamic and kinetic parameters for bacteriocin inactivation were calculated. Results showed that inactivation followed a first-order reaction with k-values between 0.059 and 0.235 min-1. D- and k-values decreased and increased, respectively, with increasing temperature, indicating a faster bacteriocin inactivation at higher temperatures. Results suggest that cerein 8A is a relatively thermostable bacteriocin with a z-value of 21.98 °C and Ea of 105.7 kJ mol-1. In a second time, the ability of chelators EDTA and sodium lactate on different concentrations and cerein 8A (3200 UA/ml-1) to inhibit and inactivate Salmonella Enteritidis was investigated. The results indicated that all treatments tested, namely EDTA, sodium lactate and cerein 8A, alone and in combination, caused a significant reduction in the OD600 values of S. Enteritidis cultures. The addition of bacteriocin plus EDTA resulted in higher inhibition in comparison with the bacteriocin alone; the greater the concentration of EDTA, the greater the inhibitory effect. Transmission electron microscopy showed damaged cell walls and loss of protoplasmic material in treated cells. The cells of S. Enteritidis treated with cerein 8A alone showed small pores and the treatment does not affect the majority of cells. When the chelating agent EDTA was added the cells appeared more damaged. The injuries in cell wall become more marked with the combination of EDTA plus cerein 8A, including noticeable discharge of intracellular material, as shown for treatments with 50 and 100 mmol l- 1EDTA plus cerein 8A. The last step of this study investigated the partitioning of cerein 8A in two liquid–liquid extraction systems that are considered promising for bioseparation and purification purposes. In aqueous two phase micellar systems Triton X-114 was chosen as the as phase-forming surfactant. Aqueous two-phase systems were prepared of PEG and inorganic salts and the addition of sodium chloride was investigated in this system. Results indicated that cerein 8A partitions preferentially to the micelle rich-phase in the system with 4% Triton X-114 concentration and its antimicrobial activity was preserved. In ATPS, the best results concerning to the partition coefficients (Kb) were obtained with PEG + ammonium sulphate, when sodium chloride was added the value of Kb increase significantly and showed the best recovery yield when compared with micellar systems. The conventional purification results a higher purification fold, but a minor recovery in comparison with partitioning methods. The successful implementation of this peptide partitioning, from a suspension containing other compounds, represents an important step towards developing a separation method for cerein 8A, and more generally, for other biomolecules of interest.

Bacillus cereus 8A, isolado de solo da região sul do Brasil, produz uma bacteriocina, cereína 8A, que apresenta potencial para utilização como bioconservante no controle de microrganismos patogênicos e deteriorantes de alimentos. Neste trabalho foram realizados estudos de caracterização e otimização no processo de obtenção da cereína semi-purificada. Na primeira etapa do trabalho foi estudada a cinética de inativação térmica para a cereína 8A. Amostras da bacteriocina foram tratadas em diferentes combinações de tempo/temperatura no intervalo de 0-30min. e 70-82°C e os parâmetros termodinâmicos e cinéticos para a inativação da cereína 8A foram calculados. Os resultados revelaram que a inativação segue uma reação de primeira ordem com valores de k entre 0.059 e 0.235 min-1. A diminuição e o aumento dos valores de D e k, respectivamente, com o aumento da temperatura, indicaram uma rápida inativação de bacteriocina a temperaturas mais elevadas. Os resultados sugerem que a cereína 8A é uma bacteriocina relativamente termoestável com um valor de z de 21.98ºC e energia de ativação de 105.7 kJ mol-1. Em um segundo momento, a capacidade dos quelantes EDTA e lactato de sódio em diferentes concentrações e da cereína 8A (3200 UA/ml-1) em inibir e inativar a Salmonella Enteritidis foram analisadas. Os resultados indicaram que todos os tratamentos testados, EDTA, lactato de sódio e cereína 8A, sozinhos e em combinação, causaram uma redução significativa nos valores de OD600 em culturas de S. Enteritidis. A combinação de cerein 8A acrescido EDTA 100 mol l-1 resultou em um tratamento mais eficaz para reduzir o número de células viáveis de S. enteritidis. A microscopia de eletrônica de transmissão revelou paredes de células danificadas e perda de materiais protoplasmáticos nas células tratadas. As células de S. enteritidis tratadas com 8A cereína sozinha mostraram pequenos poros e o tratamento não afetou a maioria das células. Quando o agente quelante EDTA foi adicionado, as células mostraram-se mais danificadas. As lesões na parede celular tornaram-se mais intensas com a combinação de cereína 8A acrescida de EDTA, inclusive demonstrando uma notável perda do material intracelular, como observado nos resultados dos tratamentos com EDTA 50 e 100 mmol l-1 mais cereína 8A. A última etapa deste estudo investigou o particionamento da cereína 8A em dois sistemas de extração líquido-líquido, um com Triton X-114 e outro PEG com sais inorgânicos, que são considerados promissores para fins de bioseparação e depuração. Os resultados indicaram que cereína 8A particiona preferencialmente na fase rica em micela no sistema com Triton X-114 na concentração de 4 % e sua atividade antimicrobiana foi preservado. Em ATPS, os melhores resultados foram relativos ao coeficiente de partição obtidos com PEG e sulfato de amônio, quando o cloreto de sódio foi adicionado, o valor do Kb aumentou significativamente e mostrou o melhor rendimento de recuperação quando comparado com o sistema micelar. A purificação convencional resulta em um fator de purificação superior, mas em uma recuperação menor em comparação com métodos de particionamento. Estes resultados representam um importante passo no sentido de desenvolver um método de separação para cereína 8A e de um modo mais geral, para outras biomoléculas de interesse. / The bacteriocin cerein 8A, produced by a strain of B. cereus 8A, isolated from soil of south of Brazil with potential application against food spoilage and pathogenic bacteria.At the first phase of the study, the kinetics of thermal inactivation was studied for the bacteriocin cerein 8A. Samples of cerein 8A were treated at different time-temperature combinations in the range of 0-30 min and 70-82°C and the thermodynamic and kinetic parameters for bacteriocin inactivation were calculated. Results showed that inactivation followed a first-order reaction with k-values between 0.059 and 0.235 min-1. D- and k-values decreased and increased, respectively, with increasing temperature, indicating a faster bacteriocin inactivation at higher temperatures. Results suggest that cerein 8A is a relatively thermostable bacteriocin with a z-value of 21.98 °C and Ea of 105.7 kJ mol-1. In a second time, the ability of chelators EDTA and sodium lactate on different concentrations and cerein 8A (3200 UA/ml-1) to inhibit and inactivate Salmonella Enteritidis was investigated. The results indicated that all treatments tested, namely EDTA, sodium lactate and cerein 8A, alone and in combination, caused a significant reduction in the OD600 values of S. Enteritidis cultures. The addition of bacteriocin plus EDTA resulted in higher inhibition in comparison with the bacteriocin alone; the greater the concentration of EDTA, the greater the inhibitory effect. Transmission electron microscopy showed damaged cell walls and loss of protoplasmic material in treated cells. The cells of S. Enteritidis treated with cerein 8A alone showed small pores and the treatment does not affect the majority of cells. When the chelating agent EDTA was added the cells appeared more damaged. The injuries in cell wall become more marked with the combination of EDTA plus cerein 8A, including noticeable discharge of intracellular material, as shown for treatments with 50 and 100 mmol l- 1EDTA plus cerein 8A. The last step of this study investigated the partitioning of cerein 8A in two liquid–liquid extraction systems that are considered promising for bioseparation and purification purposes. In aqueous two phase micellar systems Triton X-114 was chosen as the as phase-forming surfactant. Aqueous two-phase systems were prepared of PEG and inorganic salts and the addition of sodium chloride was investigated in this system. Results indicated that cerein 8A partitions preferentially to the micelle rich-phase in the system with 4% Triton X-114 concentration and its antimicrobial activity was preserved. In ATPS, the best results concerning to the partition coefficients (Kb) were obtained with PEG + ammonium sulphate, when sodium chloride was added the value of Kb increase significantly and showed the best recovery yield when compared with micellar systems. The conventional purification results a higher purification fold, but a minor recovery in comparison with partitioning methods. The successful implementation of this peptide partitioning, from a suspension containing other compounds, represents an important step towards developing a separation method for cerein 8A, and more generally, for other biomolecules of interest.

Bacillus cereus 8A, isolado de solo da região sul do Brasil, produz uma bacteriocina, cereína 8A, que apresenta potencial para utilização como bioconservante no controle de microrganismos patogênicos e deteriorantes de alimentos. Neste trabalho foram realizados estudos de caracterização e otimização no processo de obtenção da cereína semi-purificada. Na primeira etapa do trabalho foi estudada a cinética de inativação térmica para a cereína 8A. Amostras da bacteriocina foram tratadas em diferentes combinações de tempo/temperatura no intervalo de 0-30min. e 70-82°C e os parâmetros termodinâmicos e cinéticos para a inativação da cereína 8A foram calculados. Os resultados revelaram que a inativação segue uma reação de primeira ordem com valores de k entre 0.059 e 0.235 min-1. A diminuição e o aumento dos valores de D e k, respectivamente, com o aumento da temperatura, indicaram uma rápida inativação de bacteriocina a temperaturas mais elevadas. Os resultados sugerem que a cereína 8A é uma bacteriocina relativamente termoestável com um valor de z de 21.98ºC e energia de ativação de 105.7 kJ mol-1. Em um segundo momento, a capacidade dos quelantes EDTA e lactato de sódio em diferentes concentrações e da cereína 8A (3200 UA/ml-1) em inibir e inativar a Salmonella Enteritidis foram analisadas. Os resultados indicaram que todos os tratamentos testados, EDTA, lactato de sódio e cereína 8A, sozinhos e em combinação, causaram uma redução significativa nos valores de OD600 em culturas de S. Enteritidis. A combinação de cerein 8A acrescido EDTA 100 mol l-1 resultou em um tratamento mais eficaz para reduzir o número de células viáveis de S. enteritidis. A microscopia de eletrônica de transmissão revelou paredes de células danificadas e perda de materiais protoplasmáticos nas células tratadas. As células de S. enteritidis tratadas com 8A cereína sozinha mostraram pequenos poros e o tratamento não afetou a maioria das células. Quando o agente quelante EDTA foi adicionado, as células mostraram-se mais danificadas. As lesões na parede celular tornaram-se mais intensas com a combinação de cereína 8A acrescida de EDTA, inclusive demonstrando uma notável perda do material intracelular, como observado nos resultados dos tratamentos com EDTA 50 e 100 mmol l-1 mais cereína 8A. A última etapa deste estudo investigou o particionamento da cereína 8A em dois sistemas de extração líquido-líquido, um com Triton X-114 e outro PEG com sais inorgânicos, que são considerados promissores para fins de bioseparação e depuração. Os resultados indicaram que cereína 8A particiona preferencialmente na fase rica em micela no sistema com Triton X-114 na concentração de 4 % e sua atividade antimicrobiana foi preservado. Em ATPS, os melhores resultados foram relativos ao coeficiente de partição obtidos com PEG e sulfato de amônio, quando o cloreto de sódio foi adicionado, o valor do Kb aumentou significativamente e mostrou o melhor rendimento de recuperação quando comparado com o sistema micelar. A purificação convencional resulta em um fator de purificação superior, mas em uma recuperação menor em comparação com métodos de particionamento. Estes resultados representam um importante passo no sentido de desenvolver um método de separação para cereína 8A e de um modo mais geral, para outras biomoléculas de interesse. / The bacteriocin cerein 8A, produced by a strain of B. cereus 8A, isolated from soil of south of Brazil with potential application against food spoilage and pathogenic bacteria.At the first phase of the study, the kinetics of thermal inactivation was studied for the bacteriocin cerein 8A. Samples of cerein 8A were treated at different time-temperature combinations in the range of 0-30 min and 70-82°C and the thermodynamic and kinetic parameters for bacteriocin inactivation were calculated. Results showed that inactivation followed a first-order reaction with k-values between 0.059 and 0.235 min-1. D- and k-values decreased and increased, respectively, with increasing temperature, indicating a faster bacteriocin inactivation at higher temperatures. Results suggest that cerein 8A is a relatively thermostable bacteriocin with a z-value of 21.98 °C and Ea of 105.7 kJ mol-1. In a second time, the ability of chelators EDTA and sodium lactate on different concentrations and cerein 8A (3200 UA/ml-1) to inhibit and inactivate Salmonella Enteritidis was investigated. The results indicated that all treatments tested, namely EDTA, sodium lactate and cerein 8A, alone and in combination, caused a significant reduction in the OD600 values of S. Enteritidis cultures. The addition of bacteriocin plus EDTA resulted in higher inhibition in comparison with the bacteriocin alone; the greater the concentration of EDTA, the greater the inhibitory effect. Transmission electron microscopy showed damaged cell walls and loss of protoplasmic material in treated cells. The cells of S. Enteritidis treated with cerein 8A alone showed small pores and the treatment does not affect the majority of cells. When the chelating agent EDTA was added the cells appeared more damaged. The injuries in cell wall become more marked with the combination of EDTA plus cerein 8A, including noticeable discharge of intracellular material, as shown for treatments with 50 and 100 mmol l- 1EDTA plus cerein 8A. The last step of this study investigated the partitioning of cerein 8A in two liquid–liquid extraction systems that are considered promising for bioseparation and purification purposes. In aqueous two phase micellar systems Triton X-114 was chosen as the as phase-forming surfactant. Aqueous two-phase systems were prepared of PEG and inorganic salts and the addition of sodium chloride was investigated in this system. Results indicated that cerein 8A partitions preferentially to the micelle rich-phase in the system with 4% Triton X-114 concentration and its antimicrobial activity was preserved. In ATPS, the best results concerning to the partition coefficients (Kb) were obtained with PEG + ammonium sulphate, when sodium chloride was added the value of Kb increase significantly and showed the best recovery yield when compared with micellar systems. The conventional purification results a higher purification fold, but a minor recovery in comparison with partitioning methods. The successful implementation of this peptide partitioning, from a suspension containing other compounds, represents an important step towards developing a separation method for cerein 8A, and more generally, for other biomolecules of interest.

Uma bactéria identificada como Bacillus sp. P34 isolada de intestino de peixe (Leporinus sp.) da Bacia Amazônica foi estudada quanto a sua capacidade de produzir substâncias do tipo-bacteriocina. As condições ótimas para produção da substância antimicrobiana foram determinadas. A produção da atividade antimicrobiana foi observada começando na fase exponencial de crescimento, sendo a atividade máxima observada no início da fase estacionária. Os resultados da Análise de Superfície de Resposta mostraram que a máxima produção da atividade antimicrobiana ocorreu a pH inicial entre 6.0 e 8.0 e temperaturas entre 25 e 37°C. A substância inibiu bactérias patogênicas e deteriorantes importantes em alimentos como Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Aeromonas hydrophila, Erwinia carotovora e Pasteurella haemolytica. O teste de termoestabilidade mostrou a perda de atividade quando a temperatura alcançou 100°C por 15 minutos. Foi sensível à ação das enzimas proteolíticas tripsina, papaína e pronase E. A substância antimicrobiana apresentou efeito bactericida e bacteriolítico sobre L. monocytogenes e B. cereus a 160 UA ml-1. O crescimento de Escherichia coli and Salmonella Enteritidis foi inibido somente quando o agente quelante EDTA foi adicionado juntamente. A atividade esporocida não foi observada. A análise da cultura de L. monocytogenes depois do tratamento com o composto antimicrobiano, usando espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier mostrou alterações no perfil de ácidos graxos e fosfolipídios da membrana celular bacteriana. Há evidências de que seu modo de ação interfira na membrana e na parede celular. A substância foi purificada pelo seguinte protocolo: precipitação com sulfato de amônio, cromatografias de gel filtração e de troca iônica. O peso molecular da substância foi determinado por espectroscopia de massas sendo 1498.68 Da. A substância antimicrobiana purificada apresentou sensibilidade ao tratamento com proteases e manutenção da atividade foi observada após congelamento e à incubação de 70°C por 30 minutos. / A bacterium identified as Bacillus sp. strain P34 isolated from fish intestine (Leporinus sp.) from the Amazon basin was studied in its capacity to produce bacteriocinlike substances. The optimal conditions for producing the antimicrobial activity have been established. The antimicrobial activity was produced starting at the exponencial growth phase, and maximum activity was observed at early stationary phase. Response-surface data showed that maximum antimicrobial activity production was at initial pH between 6.0 and 8.0 and temperature between 25 and 37°C. The antimicrobial substance inhibited pathogenic and spoilage food bacteria such as Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Aeromonas hydrophila, Erwinia carotovora and Pasteurella haemolytica. The thermoestability test showed the loss of activity when the temperature reached 100°C for 15 min. It was sensitive to the proteolytic action of trypsin, papain and pronase E. The antimicrobial substance was bactericidal and bacteriolytic to L. monocytogenes and B. cereus at 160 AU ml-1. Growth of Escherichia coli and Salmonella Enteritidis was inhibited, but only when the chelating agent EDTA was co-added. Sporocidal activity was not observed. The analysis of the culture of L. monocytogenes after being treated with antimicrobial compound, using Fourier transform infrared spectroscopy, established a change in the profile that corresponding assignments of fatty acid and phospholipids. There was evidence that its mode of action to interfere with cell membrane and the cell wall. The substance was purified by the following protocol: precipitation with ammonium sulphate, gel filtration and ion exchange chromatography. The molecular weight was determined by mass spectroscopy as 1498.68 Da. Purified antimicrobial substance has shown sensitivity to protease treatment and maintained activity after freezing and incubation at 70°C for 30 min.