Le diabète insipide néphrogénique (DIN) autosomal peut être causé par les
mutations du gène codant pour le canal à eau aquaporine-2 (AQP2). Un
modèle couramment utilisé pour l’étude des protéines membranaires telle
l’AQP2 est l’expression hétérologue dans les ovocytes de Xenopus laevis.
Malheureusement, les techniques déjà existantes de purification de membranes
plasmiques sont soit trop longues, trop difficiles ou demandent trop de matériel,
ne permettent pas l’analyse adéquate du ciblage des formes sauvage comme
mutantes, un élément crucial de ce type d’étude. Nous avons donc dans un
premier temps mis au point une technique rapide et efficace de purification de
membranes plasmiques qui combine la digestion partielle de la membrane
vitelline, sa polymérisation à la membrane plasmique suivi de centrifugations à
basse vitesse pour récolter les membranes purifiées. Nous avons utilisé cette
technique dans l’étude de deux nouveaux cas familiaux de patients
hétérozygotes possédant les mutations V24A et R187C dans un cas et K228E et
R187C dans le second cas. Pour chaque mutation, nous avons analysé autant
les éléments de fonctionnalité que les paramètres d’expression des protéines
mutantes. Les expériences de perméabilité membranaire démontrent que les
ovocytes exprimant AQP2-V24A (Pf = 16.3 ± 3.5 x 10-4 cm/s, 10 ng) et AQP2-
K228E (Pf = 19.9 ± 7.0 x 10-4 cm/s, 10 ng) ont des activités similaires à celle
exprimant la forme native (Pf = 14.4 ± 5.5 x 10-4 cm/s, 1 ng), tandis que AQP2-
R187C (Pf = 2.6 ± 0.6 x 10-4 cm/s, 10 ng) ne semble avoir aucune activité
comme ce qui est observé chez les ovocytes non-injectés (Pf = 2.8 ± 1.0 x 10-4
cm/s). Les études de co-expression ont démontré un effet d’additivité lorsque
AQP2-V24A et -K228E sont injectées avec la forme native et un effet
s’apparentant à la dominance négative lorsque AQP2-R187C est injecté avec la
forme native, avec AQP2-V24A ou avec –K228E. Les résultats obtenus par
immunobuvardage représente bien ce qui a été démontré précédemment, on
remarque la présence des mutations K228E, V24A et la forme sauvage à la
membrane plasmique, contrairement à la mutation R187C. Cependant, lorsque
les mutations sont exprimées dans des cellules mIMCD-3, il n’y a qu’une faible
expression à la membrane de la forme –K228E et une absence totale des formes
–V24A et –R187C à la membrane plasmique, contrairement à la forme native.
Les résultats de nos études démontrent que tout dépendant du système
d’expression les formes –K228E et –V24A peuvent être utiles dans l’étude des
problèmes d’adressage à la membrane à l’aide de chaperonne chimique. De
plus, la forme –R187C démontre des difficultés d’adressage qui devront être
étudiées afin de mieux comprendre la synthèse des formes natives. / The autosomal nephrogenic diabetes insipidus (NDI) is caused by mutations of
the gene coding for the water channel aquaporine-2 (AQP2). An oftenly used
model for the study of membrane proteins such as AQP2 is the heterogenous
expression in Xenopus laevis oocytes. Unfortunately, the existing techniques of
plasma membranes purification are either too long, too difficult or require too
much material, which does not allow adequate analysis of targeting of the
native and mutants forms, which is crucial for this type of study. We developed
a fast and effective plasma membrane purification technique which combines
partial digestion of the vitellin membrane, its polymerization with the plasma
membrane followed by a serie of low speed centrifugations to collect the
purified membranes. We used this technique to study of two new family cases
of heterozygote patients carrying the V24A and R187C mutations in a case and
K228E and R187C in the second case. For each mutation, we analyzed the
functionality and the parameters of expression of the mutant proteins. The
membrane permeability experiments show that the oocytes expressing AQP2-
V24A (Pf = 16.3 ± 3.5 x 10-4 cm/s, 10 ng) and AQP2-K228E (Pf = 19.9 ± 7.0 x
10-4 cm/s, 10 ng) have similar activities to the oocytes expressing the native
form (Pf = 14.4 ± 5.5 x 10-4 cm/s, 1 ng), while AQP2-R187C (Pf = 2.6 ± 0.6 x
10-4 cm/s, 10 ng) doesn’t seem to have any activity like the un-injected oocytes
(Pf = 2.8 ± 1.0 x 10-4 cm/s). The coexpression studies showed an additive effect
when AQP2-V24A and -K228E are injected with the native form and an effect
being associated with negative dominance when AQP2-R187C was injected
with AQP2-V24A, -K228E and the native form. Western blot results
confirmed what was observed in the functionality studies. However, when the
mutations were expressed in mIMCD-3 cells, there was a slight expression of
the K228E mutation to the plasma membrane and a total absence of the
mutations –V24A and R187C at the plasma membrane. The results of our
studies showed that depending on the expression system the mutations –K228E
and -V24A can be used in targeting studies using chemical chaperones.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMU.1866/4379 |
| Date | 06 1900 |
| Creators | Leduc-Nadeau, Alexandre |
| Contributors | Bichet, Daniel G. |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Thèse ou Mémoire numérique / Electronic Thesis or Dissertation |
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