Presentada a la Universidad de Chile para optar al Grado de Doctor en Farmacología / Doxorrubicina es un efectivo agente quimioterápico ampliamente utilizado en el tratamiento de diversos tipos de cáncer. Sin embargo, su cardiotoxicidad es el principal factor limitante y puede presentarse como una cardiomiopatía aguda o crónica. En este último caso, el paciente puede desarrollar cardiomiopatía dilatada e incluso insuficiencia cardíaca.
Múltiples mecanismos participan en la cardiotoxicidad inducida por doxorrubicina, entre los que se incluyen formación de especies reactivas del oxígeno (ROS), alteraciones en la estructura sarcomérica, disfunción mitocondrial, sobrecarga de calcio y un conjunto de alteraciones en diferentes procesos intracelulares que conducen a la muerte de cardiomiocitos por apoptosis y/o necrosis.
Actualmente se ha propuesto a la autofagia como una forma alternativa de muerte celular. Sin embargo, para considerarla como tal, es necesario analizarla en el contexto en el cual se desarrolla y la magnitud y/o duración del estímulo que la provoca.
La autofagia es un proceso fundamental para la célula. La autofagia basal degrada proteínas de vida media larga, organelos envejecidos y material intracelular, permitiendo la reutilización del material citoplasmático. Sin embargo, en condiciones desfavorables, como la privación de nutrientes o carencia de factores de crecimiento, este proceso se activa para proporcionar sustratos para la síntesis de proteínas y ATP para restablecer la homeostasis celular. La autofagia es un proceso dinámico que procede con el secuestro de material citoplasmático dentro de vacuolas de doble membrana llamadas autofagosomas, que al fusionarse con los lisosomas, degradan el material incorporado. Diferentes vías de señalización regulan la autofagia, siendo la vía de la PI3K/AKT/mTOR una de las más importantes para inhibir este proceso.
En la literatura no está claro el efecto de la doxorrubicina sobre la autofagia debido principalmente a las diferencias en los modelos de estudio. Dado el papel fundamental de la autofagia basal en la homeostasis celular, es relevante investigar cómo la doxorrubicina altera este proceso y su relación con la muerte del cardiomiocito.
Para realizar esta investigación, en cultivos primarios de cardiomiocitos de rata neonata se expusieron a doxorrubicina 1 μM por 24 h o curso temporal, para caracterizar el tipo de muerte celular gatillada por doxorrubicina y posteriormente determinar el efecto sobre la autofagia.
Los resultados mostraron que el tratamiento con doxorrubicina 1 μM por 24 horas produjo un aumento de la muerte de los cardiomiocitos por necrosis, lo que se evidenció por incrementos en la liberación de LDH, disminución del contenido de ATP y por un aumento en la marca anexina V-FITC al compararlos con la condición control. Además se observó muerte por apoptosis, con un aumento máximo en los niveles de la proteína caspasa 3 fragmentada a las 6 horas, respecto de su condición control.
Para investigar el efecto de doxorrubicina sobre la autofagia se evaluaron los niveles de las proteínas LC3 y p62 por Western blot. Los resultados mostraron menores niveles de ambas proteínas a las 24 horas de exposición con respecto de la situación control. Estos resultados no son concluyentes para establecer que la autofagia está inhibida. Por lo tanto, para aclarar este punto se determinaron los niveles de LC3 y p62 en condición de flujo autofágico, es decir utilizando el inhibidor de la fusión autofagosoma-lisosoma, bafilomicina A durante el mismo período de tiempo de exposición a doxorrubicina. Los resultados mostraron que en la condición doxorrubicina más bafilomicina A, los niveles de las proteínas LC3 y p62 fueron menores que en la situación control más bafilomicina A. De acuerdo a las condiciones en que se mantuvieron los cardiomiocitos, los resultados indican que doxorrubicina inhibió la autofagia basal.
Para relacionar el efecto inhibitorio de doxorrubicina sobre la autofagia con la muerte celular, se determinó el porcentaje de muerte por liberación de LDH, inhibiendo la autofagia con bafilomicina A, 3-metiladenina y con un siRNA para beclin 1. Los resultados mostraron que al inhibir la autofagia en presencia de Doxorrubicina aumentó aún más el porcentaje de muerte de los cardiomiocitos. Por el contrario, la utilización del inductor de la autofagia rapamicina disminuyó el porcentaje de muerte. Estos resultados indican que la autofagia es importante para la sobrevida del cardiomiocito y que su inhibición con doxorrubicina favorece la muerte celular.
Por último, doxorrubicina aumentó los niveles de la forma fosforilada de AKT y p70S6K y disminuyó los niveles de Beclin, sugiriendo que la doxorrubicina además activa la vía transduccional que regula negativamente a la autofagia.
En conclusión, los resultados indican que la doxorrubicina inhibe la autofagia basal y contribuye a la muerte del cardiomiocito. Estos resultados se podrían postular como un nuevo mecanismo que permitiría explicar la cardiotoxicidad de este antineoplásico / Doxorubicin is an effective chemotherapeutic drug widely used in the treatment of several types of cancer. However, its cardiotoxicity represents the mayor limiting factor. Cardiotoxicity may develop as either acute or chronic cardiomyopathy. In the last case, the patient developes dilated cardiomyopathy and eventually heart failure. Multiple mechanisms have been proposed in doxorubicin-induced cardiotoxicity, including reactive oxygen species (ROS) generation, sarcomere structure alterations, mitochondrial dysfunction, calcium overload and a set of other alterations in key intracellular processes. All of them lead to the loss of cardiomyocytes by apoptosis and/or necrosis. Autophagy has been proposed as alternative form of cell death. However, it is important to bear in mind the context in which it takes place and the magnitude and/or exposure time of the stimulus. Autophagy is an essential cell process. Basal autophagy degrades long half-life proteins, aged and dysfunctional organelles and intracellular materials allowing their reutilization. However, under unfavorable conditions such as starvation or lack of growth factors, this process increases its activity by providing substrates for the synthesis of novel proteins and ATP to restore cell homeostasis. Autophagy is a dynamic process involving the engulfment of cytoplasmic materials within double membrane vacuoles called autophagosomes. Then, they fused with lysosomes to degrade the sequestered material. Different signaling pathways regulate autophagy, being the PI3K/AKT/mTOR pathway one of the most important to inhibit this process. In the literature, it remains unclear the effect of doxorubicin on cardiomyocyte basal autophagy due to the different experimental models and conditions used in those works. Given the key role of basal autophagy on cell homeostasis, it is important to investigate if doxorubicin can alter this process and its relationship with cardiomyocyte death. To this end, cultured rat neonatal cardiomyocytes were exposed to doxorubicin 1 μM per 24 hours to investigate the type of cell death triggered by doxorubicin and subsequently to determine the effect on basal autophagy. The results showed that doxorubicin treatment for 24 h stimulated cardiomyocyte death by necrosis, as evidenced by increased LDH release, a drop in ATP content and by increased annexin V-FITC staining relative to control. Cardiomyocyte apoptosis was also observed, reaching a peak in the levels of cleaved caspase 3 after 6 h treatment with doxorubicin. To study the effect of doxorubicin on autophagy, LC3 and p62 protein levels by assessed by Western blot. The results showed that doxorubicin reduced the levels of both proteins after 24 hours of exposure respect to controls. However, we cannot conclude that autophagy is inhibited. To clarify this point we determined LC3 and p62 protein levels under conditions of autophagy flux, using bafilomycin A. The results showed autophagy flux was also inhibits by doxorubicin. These results suggest that doxorubicin inhibits cardiomyocyte basal autophagy. To investigate the relationship between the inhibitory effect of doxorubicin on autophagy and cardiomyocyte death, the percentage released LDH was evaluated using bafilomycin A, 3-methyladenine or a siRNA for Beclin1. The results showed that the inhibition of autophagy with bafilomycin A, 3-methyladenine or siRNA for beclin 1 in the presence of doxorubicin increased even more the percentage of dead cardiomyocytes. On the other hand, the use of the inductor of autophagy rapamicyn decreased cardiomyocyte death triggered by doxorubicin. These data suggest that basal autophagy is important for cardiomyocyte survival and its inhibition promotes cell death. Finally, we found that doxorubicin stimulated AKT and p70S6K phosphorylation and decreased beclin 1 protein levels, suggesting that doxorubicin also activates this signaling pathway to negatively regulate cardiomyocyte autophagy. In summary, the results showed that doxorubicin inhibits basal autophagy and contributes to cardiomyocyte death and represent a new mechanism to explain doxorubicin cardiotoxicity / Conicyt; Fondap
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/142484 |
| Date | January 2016 |
| Creators | Pizarro Barahona, Marcela Beatriz |
| Contributors | Lavandero González, Sergio |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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