A autofagia é um processo dinâmico de degradação de componentes celulares e está reconhecidamente envolvida em processos fisiológicos e patológicos. Por isso, uma melhor compreensão do processo autofágico é necessária para permitir sua manipulação em intervenções terapêuticas. Vários métodos têm sido desenvolvidos e amplamente utilizados para a determinação de diversos aspectos do processo autofágico, porém a falta de ensaios quantitativos rápidos pode prejudicar o desenvolvimento de terapias tendo a autofagia como alvo. O marcador laranja de acridina (AO) é um fluoróforo metacromático que fluoresce vermelho em organelas vesiculares ácidas (AVOs) e verde no restante da célula, sendo assim, a marcação com AO um método rápido e barato para detecção deste tipo de organelas, que aumentam durante a indução de autofagia. Entretanto, a especificidade da marcação com AO para quantificação de autofagia tem sido questionada. Desse modo, desenvolvemos uma nova abordagem para sua análise, considerando a razão de fluorescências verde e vermelha obtida a partir de citometria de fluxo. Com essa abordagem para análise de dados de marcação com AO foi possível detectar o aumento de autofagia induzido por rapamicina, e também o bloqueio pelo inibidor de acidificação lisossomal bafilomicina A1 bem como pelo silenciamento de genes da maquinaria molecular central que controlam a autofagia em diferentes etapas. Em comparação com a forma mais comum de analisar dados de AO, que considera somente a fluorescência vermelha, os resultados obtidos com a forma de análise proposta nesse trabalho tiveram uma melhor correlação com outros métodos bem estabelecidos para quantificação de autofagia, como conversão de LC3-I/II, degradação de SQSTM1/p62 e ensaio de formação de pontos de GFP-LC3. Essa nova maneira de analisar dados da marcação com AO pode permitir que este método fácil seja utilizado como uma abordagem inicial e objetiva para a avaliação de um passo tardio do processo autofágico em células individuais, complementando a utilização de outros métodos. / Autophagy is a dynamic process of degradation of cellular components that is involved in developmental processes and various diseases. Therefore, a better understanding of autophagy is needed to allow its manipulation for therapeutic purposes. Several methods have been developed and extensively employed in determining various aspects of the autophagic process, but the lack of rapid and quantitative autophagy assays has impaired the development of autophagy-targeting therapies. Acridine orange (AO) is a cell permeable metachromatic fluorophore that fluoresces red in Acidic Vesicular Organelles (AVOs) and green in the remaining of the cell. Therefore, AO staining is a fast and cheap method to assess AVO mass in a cell, which increases upon autophagy induction. Since the specificity of AO staining for measuring autophagy has been questioned, we developed a ratiometric analysis of autophagy, considering the red-to-green fluorescence ratio to quantify data obtained from AO flow cytometry. This method measured with accuracy the increase in autophagy induced by rapamycin, which was blocked by the lysosome acidification inhibitor bafilomycin A1 as well as stable knockdown of genes that regulate different steps in the autophagy pathway. In comparison to the most-commonly used threshold, that considers only the absolute red fluorescence, the results obtained with our proposed threshold setting had higher correlation with well-established specific methods for autophagy quantification, such as LC3-I to LC3-II conversion, SQSTM1 degradation and GFP-LC3 puncta formation assay. This new way of AO data analysis will allow this simple assay to be used as an initial and objective method for evaluating the late step of the autophagic process in individual cells, complementing other methods.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:lume56.ufrgs.br:10183/131962 |
| Date | January 2015 |
| Creators | Thomé, Marcos Paulo |
| Contributors | Lenz, Guido |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS, instname:Universidade Federal do Rio Grande do Sul, instacron:UFRGS |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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