O aumento da tolerância aos fungicidas convencionais, observado em diversos gêneros de fungos de interesse, e a preocupação crescente com o meio ambiente têm estimulado o desenvolvimento de novas alternativas para o controle de fitopatógenos. Dentre as novas estratégias antimicrobianas que têm sido avaliadas, o tratamento fotodinâmico antimicrobiano (TFA) é uma das mais promissoras. O TFA baseia-se no uso de um fotossensibilizador (FS) que se acumula seletivamente nas células do microrganismo alvo. A ativação do FS pela luz, na presença de oxigênio molecular, induz à formação de espécies reativas de oxigênio, como o oxigênio singlete, que provocam a morte do microrganismo alvo, com poucos danos ao hospedeiro. Apesar de muito promissor, o TFA ainda não foi explorado para o controle de fitopatógenos. No presente estudo, foi avaliada, in planta, a eficácia do TFA com o fotossensibilizador azul de metileno (MB) e radiação solar em conídios do fungo fitopatogênico Colletotrichum acutatum. Os experimentos foram conduzidos com MB de diferentes fabricantes, em duas concentrações (25 e 50 ?M) e em diferentes formulações, ao longo das diferentes estações do ano, em dias com e sem nebulosidade e em diferentes temperaturas. O TFA com MB e radiação solar foi extremamente eficaz, matando aproximadamente 100% dos conídios em todas as condições avaliadas. Os efeitos da aplicação do MB na planta hospedeira Citrus sinensis também foram avaliados. O FS foi aplicado repetidas vezes em folhas e em flores de mudas de laranjeira. Nenhum dano foi observado nas folhas ou nas pétalas após os tratamentos com o MB. Pela primeira vez, foi feito o estudo mecanístico dos efeitos do TFA com MB em conídios de C. acutatum. Foram avaliados os efeitos do TFA na permeabilidade da membrana plasmática dos conídios e na formação de espécies reativas de oxigênio tardias, por meio da utilização das sondas fluorescentes iodeto de propídio (PI) e dihidroetídio (DHE), respectivamente. O TFA com MB danificou a membrana plasmática, reduzindo a sua permeabilidade seletiva e induziu a formação de espécies reativas de oxigênio tardias nos conídios. Também foi conduzido um estudo de longa duração, no qual foi avaliada a tolerância dos conídios de C. acutatum ao TFA com o novo azul de metileno, após cada um de 45 ciclos sucessivos de TFA, seguido pela seleção dos sobreviventes. Foram observados aumentos gradativos na tolerância ao TFA a partir do 21° ciclo de seleção. Além do aumento na tolerância, também foi observado um aumento da pigmentação dos conídios, provavelmente decorrente da seleção de mutantes que acumulam mais carotenóides. / The increasing tolerance to conventional fungicides observed in several genera of pathogenic fungi and the growing concern about the environment have stimulated the development of new alternatives to control of plant pathogens. Among the new antimicrobial strategies that have been evaluated, antimicrobial photodynamic treatment (APDT) is one of the most promising. APDT is based on the use of a photosensitizer (PS) that selectively accumulates in the target microbial cells. Activation of the PS by light in the presence of molecular oxygen induces the formation of reactive oxygen species, such as singlet oxygen, which cause damages to the target microorganism without significant harm to the host. Although very promising, APDT has not yet been used to control plant-pathogenic fungi. In the present study, the effectiveness of the APDT with the photosensitizer methylene blue (MB) and solar radiation on conidia of the plant-pathogenic fungus Colletotricum acutatum was evaluated in planta. The experiments were conducted with MB from different brands, in two concentrations (25 and 50 ?M) and different formulations, throughout the different seasons of the year, on cloudy and sunny days and at different temperatures. APDT with MB and solar radiation was extremely effective, killing around 100% of conidia in all conditions evaluated. The effects of the MB on the host plant Citrus sinensis were also evaluated. The PS was applied repeatedly on the leaves and flowers of the plants. No damage was observed on the leaves or the petals after treatment with MB. For the first time the mechanistic study evaluating the effects of APDT on C. acutatum conidia was carried out. The effects of APDT on the permeability of the conidial plasma membrane and on the production of secondary reactive oxygen species were evaluated by using the fluorescent probes propidium iodide (PI) and dihydroethidium (DHE), respectively. APDT with MB damaged the plasma membrane, reducing its selective permeability and induced the formation of secondary reactive oxygen species in conidia. It was also conducted a long term study which assessed the tolerance of conidia of C. acutatum to APDT, after each of 45 successive cycles of APDT with new methylene blue followed by the selection of the survivors. A gradual increase in APDT tolerance was observed from the 21st cycle. Besides the increase in tolerance to APDT, it was also observed an increase in the pigmentation of conidia probably due to the selection of mutants that accumulate more carotenoids.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-03102016-160949 |
| Date | 14 June 2016 |
| Creators | Gonzales, Júlia Cunha |
| Contributors | Braga, Gilberto Ubida Leite |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Reter o conteúdo por motivos de patente, publicação e/ou direitos autoriais. |
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