O crescente aumento da tolerância aos fungicidas atualmente utilizados é um dos principais problemas tanto na área clínica quanto na agrícola e tem estimulado o desenvolvimento de estratégias alternativas para o controle de fungos patogênicos, tais como o tratamento fotodinâmico antimicrobiano (TFA), que pode utilizar fotossensibilizadores (FS) de origem natural ou sintética. Alguns FS, como as cumarinas e furanocumarinas, são produzidos por espécies de Citrus como limão Tahiti (Citrus latifolia) e toranjas (Citrus paradisi). O presente estudo investigou o TFA in vitro de conídios do fungo fitopatogênico Colletotrichum acutatum com: (1) o corante fenotiazínico azul de metileno (MB), (2) uma furanocumarina comercial, 8-metoxipsoraleno (8-MOP), (3) uma cumarina comercial, (2H-chromen-2-one), (4) a cumarina 5,7-dimetoxicumarina extraída no presente trabalho a partir de óleo da casca do limão Tahiti, (5) a cumarina 7-hidroxicumarina extraída no presente trabalho a partir de óleo essencial de toranja rubi, (6) duas frações extraídas por De Menezes e colaboradores (2014a) a partir de um resíduo da indústria citrícola, uma delas constituída pela furanocumarina isopimpinelina e outra constituída por uma mistura das cumarinas 7-metoxicumarina e 5,7-dimetoxicumarina (3:1), (7) cinco extratos brutos obtidos a partir de óleos da casca e essencial de limão Tahiti e óleos essenciais de toranjas rubi e branca. Com exceção do extrato bruto obtido do óleo essencial de toranja branca, todos os demais extratos apresentaram cumarinas e/ou furanocumarinas em sua composição. As suspensões de conídios foram tratadas com os diferentes compostos (50 ?M para os compostos comerciais e as frações puras e 12,5 mg L-1 para os extratos e a mistura) e expostas à radiação solar por 1 h. O MB foi exposto à radiação solar por 30 min, 1 e 2 h. Determinou-se o efeito do tratamento fotodinâmico em folhas de mudas de laranja Valencia (Citrus sinensis) com (1) 8-MOP, (2) mistura de cumarinas, (3) 5,7-dimetoxicumarina e (4) o extrato bruto de limão Tahiti. Adicionalmente, experimentos para avaliar a estabilidade do 8-MOP exposto à radiação solar por até 12 h foram realizados. Nesses experimentos, soluções de 8-MOP (50 ?M) foram expostas à radiação solar e alíquotas foram retiradas após os diferentes tempos de exposição. Após as exposições, estudos de espectroscopia de absorção no UV e emissão de fluorescência foram realizados, além da realização de experimentos para avaliar a eficácia do TFA com os FS previamente expostos à radiação solar por 6 e 12 h. Os TFA mais eficazes foram com o MB, 8-MOP (ambos 50 ?M), a mistura de cumarinas e um dos extratos brutos obtidos de limão Tahiti (ambos 12,5 mg L-1), que mataram 99,998%, 99,378%, 99,336% e 65,049% dos conídios, respectivamente, após 1 h de exposição à radiação solar. Nenhum dano nas folhas de laranja foi observado após o TFA com os compostos. Os espectros de absorção e emissão de fluorescência das soluções de 8-MOP expostas à radiação solar mostraram fotodegradação do composto após 12 h de exposição. Entretanto, as soluções de 8-MOP expostas por 6 e por 12 h ainda foram capazes de matar 99,978% e 95,591% dos conídios de C. acutatum, respectivamente / Increasing tolerance to currently used fungicides is a major problem both in clinical and agricultural areas and has stimulated the development of alternative strategies to control pathogenic fungi such as the antimicrobial photodynamic treatment (APDT), that can use natural or synthetic photosensitizers (PS). Some PS, such as coumarins and furocoumarins are produced by Citrus species such Tahiti acid lime (Citrus latifolia) and grapefruit (Citrus paradisi). This study investigated the in vitro APDT of conidia of the plant-pathogenic fungi C. acutatum with: (1) the phenothiazinium dye methylene blue (MB), (2) commercial furocoumarin, 8-methoxypsoralen (8-MOP), (3) commercial coumarin (2H-chromen-2-one), (4) coumarin 5,7-dimethoxycoumarin, extracted in this study from Tahiti lime peel oil, (5) coumarin 7-hidroxycoumarina, extracted in this study from ruby grapefruit essential oil, (6) two fractions extracted by De Menezes et al (2014a) from a Citrus industry residue, one of them constituted by the furocoumarin isopimpinellin, and the other constituted by the mixture of coumarins 7-methoxycoumarin and 5,7-dimethoxycoumarin (3:1), (7) five crude extracts obtained from Tahiti lime peel or essential oil and ruby and white grapefruit essential oil. Except the extract from the white grapefruit, all the others presented coumarins and/or furocoumarins in their composition. Conidial suspentions were treated with the different PS (50 ?M for commercial and pure compounds and 12.5 mg L-1 for the extracts and the mixture) and exposed to solar radiation for 1 h. The MB was exposed to solar radiation for 30 min, 1 and 2 h. The APDT effect on the leaves of Valencia orange trees (Citrus sinensis) with (1) 8-MOP, (2) the mixture of coumarins, (3) 5,7-dimethoxycoumarin, and (4) the most efective extract from Tahiti lime were determined. Additionally, experiments to assess the 8-MOP stability after exposure to solar radiation for 12 h were realized. 8-MOP solutions (50 ?M) were exposed under solar radiation and rates were removed after different times of exposition. After the expositions, absorption spectroscopic studies in UV and fluorescence emission were realized, as well as holding the realization of experiments of APDT efficacy evaluation after 6 and 12 h to exposure under solar radiation. The more effective treatments were with MB, 8-MOP (both 50 ?M), the coumarins mixture and one of the extracts from Tahiti lime (both 12.5 mg L-1), killing at least 99,998%, 99,378%, 99,336% and 65,049% of the conidia, respectively after 1 h under solar radiation. No damage to orange tree leaves was observed after APDT with any of the compounds. The absorption and fluorescence intensity spectra showed the 8-MOP photodegradation after 12 h of exposition, although the 8-MOP solutions exposed under solar radiation for 6 and 12 h still killed at least 99,978% and 95,591% of the C. acutatum conidia, respectively

O gênero Neoscytalidium está crescentemente sendo associado às infecções superficiais e profundas causadas em pacientes imunocomprometidos e imunocompetentes. O fungo filamentoso Neoscytalidium dimidiatum é um microrganismo saprofítico e fitopatogênico, encontrado no solo e vegetação de regiões de clima tropical e subtropical. N. dimidiatum var. hyalinum e N. dimidiatum estão envolvidos em infecções superficiais de pele e unha sendo que a espécie produtora de melanina, N. dimidiatum, está associado preferencialmente a infecções profundas sugerindo que a espécie variante não produtora de melanina, N. dimidiatum var. hyalinum, pode ser menos virulenta que a pigmentada. Pouco é descrito na literatura sobre as variedades em questão tanto em relação à sensibilidade a drogas antifúngicas e ao tratamento fotodinâmico antimicrobiano (TFDA), bem como a características fisiológicas referentes à tolerância a variações de temperatura e pH. Assim, o presente trabalho teve como objetivo o estudo de isolados clínicos de N. dimidiatum e N. dimidiatum var. hyalinum obtidos de infecções de pele e unha. Neste estudo foram realizadas a identificação molecular, a filogenia multilocus, a verificação in vitro do desenvolvimento em diferentes temperaturas e pHs e a caracterização in vitro do perfil de susceptibilidade a antifúngicos e TFDA com fotossensibilizadores (FSs) fenotiazínicos, bem como os efeitos do TFDA nas biomoléculas dos artroconídios das variedades estudadas. A filogenia multilocus foi realizada pelo sequenciamento de sete diferentes loci onde foi evidenciado polimorfismo na região Internal Transcribed Spacer (ITS) 1 e nos genes ?-Tubulina (TUB), Fator de Alongamento de cadeia 1? (EF1) e Histona H3 (HH3). O agrupamento dos isolados clínicos deste estudo em genótipos distintos permitiu a separação em 6 tipos de sequência (TSs), sendo que o TS5 foi composto apenas pela espécie variante N. dimidiatum var. hyalinum. A análise de desenvolvimento em diferentes temperaturas e pHs demonstrou um tamanho de colônia reduzido para todos os isolados de N. dimidiatum var. hyalinum. Anfotericina B, voriconazol e terbinafina foram os antifúngicos mais eficientes para ambas variedades. Os valores das concentrações inibitórias mínimas (CIMs) encontrados para os derivados azólicos foram baixos para todos os isolados clínicos de N. dimidiatum var. hyalinum. Os isolados clínicos de N. dimidiatum mostraram ser menos sensível ao TFDA com os FSs azul de metileno (MB), novo azul de metileno N (NMBN), azul de toluidina O (TBO) e novo derivado sintético (S137) quando comparado à variedade hialina. NMBN e S137 mostraram maior eficiência para inativação de Neoscytalidium spp. Adicionalmente, no TFDA todos os FSs apresentaram efeito de permeabilidade de membrana plasmática, embora somente NMBN e S137 apresentaram a produção de Malondialdeido (MDA), isto é, causaram a peroxidação lipídica nos artroconídios de N. dimidiatum e da variedade hialina / Neoscytalidium sp. is increasingly being associated with superficial and deep infections in immunocompromised and immunocompetent patients. The filamentous fungus Neoscytalidium dimidiatum is a saprophytic and plant pathogenic microorganism that is found in soil and vegetation of tropical and subtropical regions. N. dimidiatum var. hyalinum and N. dimidiatum are involved in superficial skin and nail infections. The melanin producer N. dimidiatum is preferably associated with deep infections suggesting that the clinical isolate without melanin, N. dimidiatum var. hyalinum, may be less virulent than the pigmented variety. Little is described in the literature regarding the varieties N. dimidiatum and N. dimidiatum var. hyalinum about the sensitivity to antifungal drugs and photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT), and the physiological characteristics related to the growth at different temperature and pH. Therefore, the present study aimed to investigate clinical isolates of N. dimidiatum and N. dimidiatum var. hyalinum obtained from skin and nail infections. Here in this study were performed the molecular identification, multilocus phylogeny, the in vitro characterization of development at different temperatures and pHs, and the characterization of in vitro susceptibility to antifungal agents and PACT with phenotiazinium photosensitizers (PSs), as well the PACT effects on the biomolecules of the Neoscytalidium spp. arthroconidia. The multilocus phylogeny was performed by sequencing seven different loci where polymorphism were identified in the Internal Transcribed Spacer (ITS) 1 region of rDNA and in the genes ?-tubulin (TUB), elongation factor 1? (EF1) and Histone H3 (HH3). The grouping of the clinical isolates from this study in different genotypes allowed the clustering in 6 sequence types (ST), in which the ST5 was composed exclusively by all N dimidiatum var. hyalinum isolates from this study. The analysis of development at different temperatures and pHs showed a reduced colony size for all N. dimidiatum var. hyalinum isolates. Amphotericin B, voriconazole and terbinafine were the most effective antifungal for both varieties. The minimal inhibitory concentrations (MICs) values found for the azoles derivatives were low for all N. dimidiatum var. hyalinum isolates. N. dimidiatum clinical isolates have shown to be less sensitive to PACT with the PS methylene blue (MB), new methylene blue (NMBN), toluidine blue O (TBO) and new synthetic derivative (S137) when compared to hyaline variety. NMBN and S137 have shown more effectiveness for the inactivation of Neoscytalidium spp. Additionally, all PS in PACT have caused plasma membrane permeability, although only NMBN and S137 showed the production of malondialdehyde (MDA), i.e., caused lipid peroxidation in both N. dimidiatum and hyaline variety

O gênero Neoscytalidium está crescentemente sendo associado às infecções superficiais e profundas causadas em pacientes imunocomprometidos e imunocompetentes. O fungo filamentoso Neoscytalidium dimidiatum é um microrganismo saprofítico e fitopatogênico, encontrado no solo e vegetação de regiões de clima tropical e subtropical. N. dimidiatum var. hyalinum e N. dimidiatum estão envolvidos em infecções superficiais de pele e unha sendo que a espécie produtora de melanina, N. dimidiatum, está associado preferencialmente a infecções profundas sugerindo que a espécie variante não produtora de melanina, N. dimidiatum var. hyalinum, pode ser menos virulenta que a pigmentada. Pouco é descrito na literatura sobre as variedades em questão tanto em relação à sensibilidade a drogas antifúngicas e ao tratamento fotodinâmico antimicrobiano (TFDA), bem como a características fisiológicas referentes à tolerância a variações de temperatura e pH. Assim, o presente trabalho teve como objetivo o estudo de isolados clínicos de N. dimidiatum e N. dimidiatum var. hyalinum obtidos de infecções de pele e unha. Neste estudo foram realizadas a identificação molecular, a filogenia multilocus, a verificação in vitro do desenvolvimento em diferentes temperaturas e pHs e a caracterização in vitro do perfil de susceptibilidade a antifúngicos e TFDA com fotossensibilizadores (FSs) fenotiazínicos, bem como os efeitos do TFDA nas biomoléculas dos artroconídios das variedades estudadas. A filogenia multilocus foi realizada pelo sequenciamento de sete diferentes loci onde foi evidenciado polimorfismo na região Internal Transcribed Spacer (ITS) 1 e nos genes ?-Tubulina (TUB), Fator de Alongamento de cadeia 1? (EF1) e Histona H3 (HH3). O agrupamento dos isolados clínicos deste estudo em genótipos distintos permitiu a separação em 6 tipos de sequência (TSs), sendo que o TS5 foi composto apenas pela espécie variante N. dimidiatum var. hyalinum. A análise de desenvolvimento em diferentes temperaturas e pHs demonstrou um tamanho de colônia reduzido para todos os isolados de N. dimidiatum var. hyalinum. Anfotericina B, voriconazol e terbinafina foram os antifúngicos mais eficientes para ambas variedades. Os valores das concentrações inibitórias mínimas (CIMs) encontrados para os derivados azólicos foram baixos para todos os isolados clínicos de N. dimidiatum var. hyalinum. Os isolados clínicos de N. dimidiatum mostraram ser menos sensível ao TFDA com os FSs azul de metileno (MB), novo azul de metileno N (NMBN), azul de toluidina O (TBO) e novo derivado sintético (S137) quando comparado à variedade hialina. NMBN e S137 mostraram maior eficiência para inativação de Neoscytalidium spp. Adicionalmente, no TFDA todos os FSs apresentaram efeito de permeabilidade de membrana plasmática, embora somente NMBN e S137 apresentaram a produção de Malondialdeido (MDA), isto é, causaram a peroxidação lipídica nos artroconídios de N. dimidiatum e da variedade hialina / Neoscytalidium sp. is increasingly being associated with superficial and deep infections in immunocompromised and immunocompetent patients. The filamentous fungus Neoscytalidium dimidiatum is a saprophytic and plant pathogenic microorganism that is found in soil and vegetation of tropical and subtropical regions. N. dimidiatum var. hyalinum and N. dimidiatum are involved in superficial skin and nail infections. The melanin producer N. dimidiatum is preferably associated with deep infections suggesting that the clinical isolate without melanin, N. dimidiatum var. hyalinum, may be less virulent than the pigmented variety. Little is described in the literature regarding the varieties N. dimidiatum and N. dimidiatum var. hyalinum about the sensitivity to antifungal drugs and photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT), and the physiological characteristics related to the growth at different temperature and pH. Therefore, the present study aimed to investigate clinical isolates of N. dimidiatum and N. dimidiatum var. hyalinum obtained from skin and nail infections. Here in this study were performed the molecular identification, multilocus phylogeny, the in vitro characterization of development at different temperatures and pHs, and the characterization of in vitro susceptibility to antifungal agents and PACT with phenotiazinium photosensitizers (PSs), as well the PACT effects on the biomolecules of the Neoscytalidium spp. arthroconidia. The multilocus phylogeny was performed by sequencing seven different loci where polymorphism were identified in the Internal Transcribed Spacer (ITS) 1 region of rDNA and in the genes ?-tubulin (TUB), elongation factor 1? (EF1) and Histone H3 (HH3). The grouping of the clinical isolates from this study in different genotypes allowed the clustering in 6 sequence types (ST), in which the ST5 was composed exclusively by all N dimidiatum var. hyalinum isolates from this study. The analysis of development at different temperatures and pHs showed a reduced colony size for all N. dimidiatum var. hyalinum isolates. Amphotericin B, voriconazole and terbinafine were the most effective antifungal for both varieties. The minimal inhibitory concentrations (MICs) values found for the azoles derivatives were low for all N. dimidiatum var. hyalinum isolates. N. dimidiatum clinical isolates have shown to be less sensitive to PACT with the PS methylene blue (MB), new methylene blue (NMBN), toluidine blue O (TBO) and new synthetic derivative (S137) when compared to hyaline variety. NMBN and S137 have shown more effectiveness for the inactivation of Neoscytalidium spp. Additionally, all PS in PACT have caused plasma membrane permeability, although only NMBN and S137 showed the production of malondialdehyde (MDA), i.e., caused lipid peroxidation in both N. dimidiatum and hyaline variety

O crescente aumento da tolerância aos fungicidas atualmente utilizados é um dos principais problemas tanto na área clínica quanto na agrícola e tem estimulado o desenvolvimento de estratégias alternativas para o controle de fungos patogênicos, tais como o tratamento fotodinâmico antimicrobiano (TFA), que pode utilizar fotossensibilizadores (FS) de origem natural ou sintética. Alguns FS, como as cumarinas e furanocumarinas, são produzidos por espécies de Citrus como limão Tahiti (Citrus latifolia) e toranjas (Citrus paradisi). O presente estudo investigou o TFA in vitro de conídios do fungo fitopatogênico Colletotrichum acutatum com: (1) o corante fenotiazínico azul de metileno (MB), (2) uma furanocumarina comercial, 8-metoxipsoraleno (8-MOP), (3) uma cumarina comercial, (2H-chromen-2-one), (4) a cumarina 5,7-dimetoxicumarina extraída no presente trabalho a partir de óleo da casca do limão Tahiti, (5) a cumarina 7-hidroxicumarina extraída no presente trabalho a partir de óleo essencial de toranja rubi, (6) duas frações extraídas por De Menezes e colaboradores (2014a) a partir de um resíduo da indústria citrícola, uma delas constituída pela furanocumarina isopimpinelina e outra constituída por uma mistura das cumarinas 7-metoxicumarina e 5,7-dimetoxicumarina (3:1), (7) cinco extratos brutos obtidos a partir de óleos da casca e essencial de limão Tahiti e óleos essenciais de toranjas rubi e branca. Com exceção do extrato bruto obtido do óleo essencial de toranja branca, todos os demais extratos apresentaram cumarinas e/ou furanocumarinas em sua composição. As suspensões de conídios foram tratadas com os diferentes compostos (50 ?M para os compostos comerciais e as frações puras e 12,5 mg L-1 para os extratos e a mistura) e expostas à radiação solar por 1 h. O MB foi exposto à radiação solar por 30 min, 1 e 2 h. Determinou-se o efeito do tratamento fotodinâmico em folhas de mudas de laranja Valencia (Citrus sinensis) com (1) 8-MOP, (2) mistura de cumarinas, (3) 5,7-dimetoxicumarina e (4) o extrato bruto de limão Tahiti. Adicionalmente, experimentos para avaliar a estabilidade do 8-MOP exposto à radiação solar por até 12 h foram realizados. Nesses experimentos, soluções de 8-MOP (50 ?M) foram expostas à radiação solar e alíquotas foram retiradas após os diferentes tempos de exposição. Após as exposições, estudos de espectroscopia de absorção no UV e emissão de fluorescência foram realizados, além da realização de experimentos para avaliar a eficácia do TFA com os FS previamente expostos à radiação solar por 6 e 12 h. Os TFA mais eficazes foram com o MB, 8-MOP (ambos 50 ?M), a mistura de cumarinas e um dos extratos brutos obtidos de limão Tahiti (ambos 12,5 mg L-1), que mataram 99,998%, 99,378%, 99,336% e 65,049% dos conídios, respectivamente, após 1 h de exposição à radiação solar. Nenhum dano nas folhas de laranja foi observado após o TFA com os compostos. Os espectros de absorção e emissão de fluorescência das soluções de 8-MOP expostas à radiação solar mostraram fotodegradação do composto após 12 h de exposição. Entretanto, as soluções de 8-MOP expostas por 6 e por 12 h ainda foram capazes de matar 99,978% e 95,591% dos conídios de C. acutatum, respectivamente / Increasing tolerance to currently used fungicides is a major problem both in clinical and agricultural areas and has stimulated the development of alternative strategies to control pathogenic fungi such as the antimicrobial photodynamic treatment (APDT), that can use natural or synthetic photosensitizers (PS). Some PS, such as coumarins and furocoumarins are produced by Citrus species such Tahiti acid lime (Citrus latifolia) and grapefruit (Citrus paradisi). This study investigated the in vitro APDT of conidia of the plant-pathogenic fungi C. acutatum with: (1) the phenothiazinium dye methylene blue (MB), (2) commercial furocoumarin, 8-methoxypsoralen (8-MOP), (3) commercial coumarin (2H-chromen-2-one), (4) coumarin 5,7-dimethoxycoumarin, extracted in this study from Tahiti lime peel oil, (5) coumarin 7-hidroxycoumarina, extracted in this study from ruby grapefruit essential oil, (6) two fractions extracted by De Menezes et al (2014a) from a Citrus industry residue, one of them constituted by the furocoumarin isopimpinellin, and the other constituted by the mixture of coumarins 7-methoxycoumarin and 5,7-dimethoxycoumarin (3:1), (7) five crude extracts obtained from Tahiti lime peel or essential oil and ruby and white grapefruit essential oil. Except the extract from the white grapefruit, all the others presented coumarins and/or furocoumarins in their composition. Conidial suspentions were treated with the different PS (50 ?M for commercial and pure compounds and 12.5 mg L-1 for the extracts and the mixture) and exposed to solar radiation for 1 h. The MB was exposed to solar radiation for 30 min, 1 and 2 h. The APDT effect on the leaves of Valencia orange trees (Citrus sinensis) with (1) 8-MOP, (2) the mixture of coumarins, (3) 5,7-dimethoxycoumarin, and (4) the most efective extract from Tahiti lime were determined. Additionally, experiments to assess the 8-MOP stability after exposure to solar radiation for 12 h were realized. 8-MOP solutions (50 ?M) were exposed under solar radiation and rates were removed after different times of exposition. After the expositions, absorption spectroscopic studies in UV and fluorescence emission were realized, as well as holding the realization of experiments of APDT efficacy evaluation after 6 and 12 h to exposure under solar radiation. The more effective treatments were with MB, 8-MOP (both 50 ?M), the coumarins mixture and one of the extracts from Tahiti lime (both 12.5 mg L-1), killing at least 99,998%, 99,378%, 99,336% and 65,049% of the conidia, respectively after 1 h under solar radiation. No damage to orange tree leaves was observed after APDT with any of the compounds. The absorption and fluorescence intensity spectra showed the 8-MOP photodegradation after 12 h of exposition, although the 8-MOP solutions exposed under solar radiation for 6 and 12 h still killed at least 99,978% and 95,591% of the C. acutatum conidia, respectively

O aumento da tolerância aos fungicidas convencionais, observado em diversos gêneros de fungos de interesse, e a preocupação crescente com o meio ambiente têm estimulado o desenvolvimento de novas alternativas para o controle de fitopatógenos. Dentre as novas estratégias antimicrobianas que têm sido avaliadas, o tratamento fotodinâmico antimicrobiano (TFA) é uma das mais promissoras. O TFA baseia-se no uso de um fotossensibilizador (FS) que se acumula seletivamente nas células do microrganismo alvo. A ativação do FS pela luz, na presença de oxigênio molecular, induz à formação de espécies reativas de oxigênio, como o oxigênio singlete, que provocam a morte do microrganismo alvo, com poucos danos ao hospedeiro. Apesar de muito promissor, o TFA ainda não foi explorado para o controle de fitopatógenos. No presente estudo, foi avaliada, in planta, a eficácia do TFA com o fotossensibilizador azul de metileno (MB) e radiação solar em conídios do fungo fitopatogênico Colletotrichum acutatum. Os experimentos foram conduzidos com MB de diferentes fabricantes, em duas concentrações (25 e 50 ?M) e em diferentes formulações, ao longo das diferentes estações do ano, em dias com e sem nebulosidade e em diferentes temperaturas. O TFA com MB e radiação solar foi extremamente eficaz, matando aproximadamente 100% dos conídios em todas as condições avaliadas. Os efeitos da aplicação do MB na planta hospedeira Citrus sinensis também foram avaliados. O FS foi aplicado repetidas vezes em folhas e em flores de mudas de laranjeira. Nenhum dano foi observado nas folhas ou nas pétalas após os tratamentos com o MB. Pela primeira vez, foi feito o estudo mecanístico dos efeitos do TFA com MB em conídios de C. acutatum. Foram avaliados os efeitos do TFA na permeabilidade da membrana plasmática dos conídios e na formação de espécies reativas de oxigênio tardias, por meio da utilização das sondas fluorescentes iodeto de propídio (PI) e dihidroetídio (DHE), respectivamente. O TFA com MB danificou a membrana plasmática, reduzindo a sua permeabilidade seletiva e induziu a formação de espécies reativas de oxigênio tardias nos conídios. Também foi conduzido um estudo de longa duração, no qual foi avaliada a tolerância dos conídios de C. acutatum ao TFA com o novo azul de metileno, após cada um de 45 ciclos sucessivos de TFA, seguido pela seleção dos sobreviventes. Foram observados aumentos gradativos na tolerância ao TFA a partir do 21° ciclo de seleção. Além do aumento na tolerância, também foi observado um aumento da pigmentação dos conídios, provavelmente decorrente da seleção de mutantes que acumulam mais carotenóides. / The increasing tolerance to conventional fungicides observed in several genera of pathogenic fungi and the growing concern about the environment have stimulated the development of new alternatives to control of plant pathogens. Among the new antimicrobial strategies that have been evaluated, antimicrobial photodynamic treatment (APDT) is one of the most promising. APDT is based on the use of a photosensitizer (PS) that selectively accumulates in the target microbial cells. Activation of the PS by light in the presence of molecular oxygen induces the formation of reactive oxygen species, such as singlet oxygen, which cause damages to the target microorganism without significant harm to the host. Although very promising, APDT has not yet been used to control plant-pathogenic fungi. In the present study, the effectiveness of the APDT with the photosensitizer methylene blue (MB) and solar radiation on conidia of the plant-pathogenic fungus Colletotricum acutatum was evaluated in planta. The experiments were conducted with MB from different brands, in two concentrations (25 and 50 ?M) and different formulations, throughout the different seasons of the year, on cloudy and sunny days and at different temperatures. APDT with MB and solar radiation was extremely effective, killing around 100% of conidia in all conditions evaluated. The effects of the MB on the host plant Citrus sinensis were also evaluated. The PS was applied repeatedly on the leaves and flowers of the plants. No damage was observed on the leaves or the petals after treatment with MB. For the first time the mechanistic study evaluating the effects of APDT on C. acutatum conidia was carried out. The effects of APDT on the permeability of the conidial plasma membrane and on the production of secondary reactive oxygen species were evaluated by using the fluorescent probes propidium iodide (PI) and dihydroethidium (DHE), respectively. APDT with MB damaged the plasma membrane, reducing its selective permeability and induced the formation of secondary reactive oxygen species in conidia. It was also conducted a long term study which assessed the tolerance of conidia of C. acutatum to APDT, after each of 45 successive cycles of APDT with new methylene blue followed by the selection of the survivors. A gradual increase in APDT tolerance was observed from the 21st cycle. Besides the increase in tolerance to APDT, it was also observed an increase in the pigmentation of conidia probably due to the selection of mutants that accumulate more carotenoids.