Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2014. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2014-08-14T11:27:23Z
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2014_ClaudiaPatriciaBravoChaucanes_Parcial.pdf: 2199963 bytes, checksum: 32f34de0fb4306a0e65e2ee1e766bf95 (MD5) / As infecções fúngicas invasivas configuram um problema grave de saúde pública, especialmente em pacientes imunocomprometidos. Mais de 90% de todas as mortes relacionadas com fungos procedem de espécies que pertencem aos gêneros: Cryptococcus, Candida, Aspergillus e Pneumocystis. A Criptococose é causada pelo fungo encapsulado Cryptococcus neoformans, que causa doença pulmonar e pode-se espalhar amplamente no cérebro e pele; afeta cerca de um milhão de pessoas anualmente e mata cerca de 650.000. A virulência desse fungo é mediada por vários fatores, como a presença de uma cápsula polissacarídica anti-fagocítica e a indução de enzimas antioxidantes tais como peroxidases e catalases. Estes mecanismos antioxidantes de defesa se mostram importantes, não só para a resistência às espécies reativas, mas também para a sobrevivência em hospedeiros mamíferos. Estas enzimas antioxidantes, importantes para a virulência, podem servir como alvos excelentes para a terapia antifúngica. O gene TRR1 é essencial em C. neoformans e, codifica para a enzima citoplasmática tioredoxina redutase. Esta proteína tem um papel importante na manutenção redox da célula e é parte do complexo chamado sistema tioredoxina, no qual participam a tioredoxina (Trx), tioredoxina redutase (Trr) e NADPH, protegendo as células contra o estresse oxidativo e nitrosativo. Algumas drogas estão disponíveis para o tratamento de infecções fúngicas sistêmicas ou superficiais, contudo, existe apenas um número limitado de agentes antifúngicos eficazes (anfotericina B e o fluconazol para tratar a criptococose), muitos deles com efeitos secundários tóxicos e indesejáveis. Além disso, a resistência aos antifúngicos representa uma limitação nas atuais terapias utilizadas, demonstrando uma necessidade urgente de uma nova geração de agentes antifúngicos. No presente trabalho, a expressão heteróloga, purificação e caracterização enzimática de Trr1 e seu substrato Trx1 do fungo patogênico C. neoformans foram realizados. Os genes TRR1 e TRX1 de C. neoformans (H99) foram expressos em Escherichia coli via estratégia recombinante. Os fragmentos gênicos foram obtidos por meio da montagem de genes sintéticos inseridos no vetor pET21a para a produção como proteínas de fusão na forma solúvel. Os produtos expressos foram purificados por cromatografia de afinidade em coluna de níquel e detecção por western-blot e foi possível identificar uma banda de ̴ 39 kDa e outra de ̴ 12 kDa, correspondentes às proteínas recombinantes Trr1 e Trx1. A análise de atividade enzimática da proteína Trr1 recombinante foi realizada por ensaios de cinética enzimática. Os parâmetros cinéticos Vmáx e Km foram determinados variando a concentração de Trx1 de 0.25 μM até 15 μM. Como resultado a velocidade de reação foi aumentando gradualmente à medida que a concentração
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de substrato crescia, mostrando assim a capacidade da Trr1 em reduzir Trx1. Este trabalho possibilitou a produção das proteínas recombinantes com atividades biológicas esperadas, proporcionando quantidades necessárias para a realização de estudos estruturais tridimensionais (3D). Como resultado preliminar foi identificado o crescimento dos cristais para a proteína recombinante Trx1 de C. neoformans, em presencia do agente precipitante sulfato de amônio 2 M pelo método de difusão de vapor em gota sentada. A partir do refinamento das condições será possível encontrar uma solução ideal para a difração dos cristais de cada proteína. Diante dos resultados obtidos pelo nosso grupo, na proposta maior do projeto principal: “Pós-genoma de fungos patogênicos humanos visando o desenvolvimento de novas drogas antifúngicas”, este trabalho encontra-se inserido nesta linha de pesquisa para a obtenção de novas moléculas candidatas que inibam a atividade da proteína tioredoxina redutase, especificamente na viabilidade do fungo patogênico C. neoformans. Embora estas moléculas tenham sido selecionadas por varredura virtual de quimiotecas, uma metodologia in silico, os resultados in vitro feitos previamente em nosso grupo já apontaram o potencial destas moléculas como antifúngicos para o gênero Paracoccidioides spp. Em parceria com pesquisadores da França foi predita a estrutura da proteína Trr1 de C. neoformans por modelagem molecular por homologia. A partir da varredura virtual de quimiotecas foram selecionadas 4 moléculas inibitórias do banco Life Chemicals que interagem com os modelos de Trr1 obtidos para C. neoformans (Anexo). Os testes in vitro para validar tais inibidores potenciais estão sendo realizados em nosso laboratório, com intuito de desenvolver novas drogas para o tratamento de infecções fúngicas de relevância mundial, e gerar informações básicas da estrutura e função desta proteína. / Invasive fungal infections constitute a major public health problem, especially in immunocompromised patients. Over 90% of all deaths related to fungi come from species belonging to the genera Cryptococcus, Candida, Aspergillus and Pneumocystis. Cryptococcosis is caused by Cryptococcus neoformans, an encapsulated fungus that causes lung disease and can spread widely in the brain and skin, affects about one million people each year and kills about 650,000. The virulence of this fungus is mediated by several factors such as the presence of an anti-phagocytic polysaccharide capsule, and the induction of antioxidant enzymes such as peroxidases and catalases. These antioxidant defense mechanisms have been shown to be important not only for resistance to reactive species but also for survival in the mammalian host. These antioxidant enzymes important for virulence may serve as excellent targets for antifungal therapy. The TRR1 gene is essential and encodes the cytoplasmic thioredoxin reductase enzyme. This protein has a role in maintaining the redox balance of the cell and forms part of a complex called thioredoxin system, which contains thioredoxin (Trx), thioredoxin reductase (Trr) and NADPH, protecting cells against oxidative and nitrosative stress. Some drugs to treat systemic and superficial fungal infections are available; however, there is only a limited number of effective antifungal agents (amphotericin B and fluconazole to treat cryptococcosis) many of them are toxic and present undesirable secondary effects. Furthermore, drug resistance is a limitation on current therapy used, demonstrating an urgent need for a new generation of antifungal agents. In this study, heterologous expression, purification and enzymatic characterization of Trr1 and its substrate Trx1 of the fungal pathogen C. neoformans were performed. The TRX1 and TRR1 genes of C. neoformans (H99) were expressed in Escherichia coli using recombinant strategy. The gene fragments were obtained by assembling synthetic genes and these were inserted into pET21a vector for production as fusion proteins in soluble form. The expressed products were purified by affinity chromatography on nickel column and detected by western blot. It was possible to identify a band of ̴ 39 kDa and another of ̴ 12 kDa corresponding recombinant proteins Trr1 and Trx1. The enzymatic activity of the recombinant protein Trr1 was confirmed by assays of enzyme kinetics. The kinetic parameters Km and Vmáx were determined by varying the Trx1 concentration of 0.25 μM to 15 μM. As a result the reaction rate was gradually increased as the substrate concentration, showing the ability of Trr1 to reduce Trx1. In conclusion, this work shows a viable system for the production of recombinant proteins providing amount necessary to perform three-dimensional structural studies (3D). As a preliminary result crystal
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growth for recombinant protein, Trx1 of C. neoformans was identified in the presence of sulfate 2M as the precipitant agent. From the refinement of the conditions will be possible to find an ideal solution for diffraction of crystals of each protein. Considering the results obtained by our group, most of the main project proposal: "Post-genome of human pathogenic fungi aiming the development of new antifungal drugs," this work is inserted in this line of research for obtaining new candidate molecules that inhibit the activity of thioredoxin reductase protein, specifically on the viability of the pathogenic fungus C. neoformans. Although these molecules have been selected for virtual screening library, a methodology in silico, in vitro results previously made in our group have pointed out the potential of these molecules as antifungal in the Paracoccidioides genus. In collaboration with researchers from France, the structure of the protein Trr1 of C. neoformans was predicted by molecular homology modeling. From the virtual screening library, four inhibitory molecules that interact with the Trr1 models obtained for C. neoformans were selected from Life Chemicals database (Appendix). Currently in vitro tests to validate these potential inhibitors are being carried out in our laboratory, aiming at developing new drugs for the treatment of fungal infections of global significance, and generating basic information on the structure and function of this protein.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/16078 |
| Date | 28 November 2014 |
| Creators | Bravo Chaucanés, Claudia Patrícia |
| Contributors | Felipe, Maria Sueli Soares |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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