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Previous issue date: 2007-02-27 / Financiadora de Estudos e Projetos / Cysteine proteases are enzymes found in many organisms and are
characterized by the presence of cysteine residue in their active site. These
proteases play an important role in the organism metabolism. In pathogenic
organisms, for example, cysteine proteases may be involved in the pathogenicity
process by unbalancing of the biological functions of the host (biochemical and
physiological regulation). Since they are involved in several diseases, these enzymes
have been considered of great interest for many researchers.
The current work aims to express in E. coli a recombinant form of an ORF
XAC2853 predicted to be a cysteine protease by annotation of the genome of
Xanthomonas axonopodis pv citri. This bacterium is responsible for citrus canker, an
infection affecting citrus species which can be evidenced by superficial lesions and
early fall of leaves and fruits, thus resulting in significant losses to world agriculture.
After expression, the protein was purified by nickel column affinity chromatography
and inclusion body solubilization, inasmuch as this protein is almost fully insoluble.
The purified protein was used to investigate the activity against such synthetic
substrates as Z-FR-MCA and Z-RR-MCA, and no proteolytic activity was found.
However, studies in vivo using clones of E. coli expressing the recombinant protein
evidenced proteolytic activity against casein.
In an attempt to demonstrate the involvement of this probable protease in the
pathogenicity of Xac, the knockout of the cromossomal gene in Xac was performed.
A mutant having the disrupted gene was obtained and characterized. The assays of
the mutant growth, when compared with the wild strain, indicate that the cysteine
protease may be involved in the pathogenicity of Xac, since the inactivation of its
gene by the transposon insertion resulted in a less virulent strain. In this sense, this
protein may be a promising target for the combat of citrus canker. / As cisteíno proteases são enzimas presentes nos diferentes organismos e
são caracterizadas pela presença de um resíduo de cisteína em seu sítio ativo.
Essas proteases apresentam relevante papel no metabolismo desses organismos.
No caso de organismos patogênicos, por exemplo, podem estar envolvidas no
processo de patogenicidade por gerar o desequilíbrio das funções biológicas do
hospedeiro (regulação bioquímica e fisiológica). Por esta razão, essas enzimas tem
sido alvo de grande interesse por parte dos pesquisadores, uma vez que se
encontram envolvidas em diversas doenças.
Neste trabalho visamos à expressão em E. coli da forma recombinante de
uma ORF XAC2853 predita como uma cisteíno protease na anotação do genoma de
Xanthomonas axonopodis pv citri. Esta bactéria é responsável pelo cancro cítrico,
uma infecção que afeta citros, caracterizando-se pelo aparecimento de lesões
superficiais e queda precoce de folhas e frutos, resultando em grandes perdas para
a agricultura mundial. Uma vez expressa a proteína, a mesma foi purificada por
afinidade em coluna de níquel assim como pela solubilização dos corpos de
inclusão, pois esta proteína encontra-se quase que exclusivamente insolúvel. A
proteína purificada foi utilizada nos estudos de atividade contra os substratos
sintéticos Z-FR-MCA e Z-RR-MCA não sendo verificada atividade proteolítica. No
entanto, estudos de atividade realizados in vivo, com clones de E. coli expressando
a proteína recombinante, demonstraram atividade proteolítica contra a caseína.
Na busca de demonstrar o envolvimento desta provável protease na
patogenicidade de Xac, foi realizado o nocaute do gene cromossomal que a
codifica na bactéria. Um mutante com o gene inativado pela inserção de um
transposon foi obtido e caracterizado, e os ensaios de crescimento desse mutante,
comparado com o crescimento da linhagem selvagem, permitem concluir que a
cisteíno protease estudada pode estar envolvida na patogenicidade de Xac, uma vez
que a inativação do seu gene pela inserção do transposon gerou uma linhagem
menos virulenta. Desta forma, esta proteína pode ser um alvo promissor para o
combate ao cancro cítrico.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/6940 |
| Date | 27 February 2007 |
| Creators | Santos, Guilherme Rodrigo Reis Monteiro dos |
| Contributors | Silva, Flávio Henrique da |
| Publisher | Universidade Federal de São Carlos, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, UFSCar, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSCAR, instname:Universidade Federal de São Carlos, instacron:UFSCAR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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