Os fatores de transcrição da família MarR atuam como sensores diretos de sinais intracelulares e regulam vários processos em bactérias, incluindo virulência e degradação de compostos aromáticos. Neste trabalho, identificamos de modo global os fatores de transcrição da família MarR envolvidos na virulência do patógeno oportunista de humanos Chromobacterium violaceum. Usando mutagênese por troca alélica, geramos mutantes nulos não polares para doze dos quinze reguladores da família MarR encontrados no genoma de C. violaceum. Em ensaios de virulência, quando injetados por via intraperitoneal em camundongos BALB/c, os mutantes ?CV_0210 (?ohrR), ?CV_0577 e ?CV_2726 foram menos virulentos, enquanto o mutante ?CV_1776 foi mais virulento, quando comparados à linhagem selvagem. Para os demais nove mutantes MarR não houve diferença na virulência. Para definir o regulon de alguns destes reguladores da família MarR, os perfis de expressão gênica foram determinados por ensaios de microarranjo de DNA e Northern blot para as linhagens mutantes ?CV_0210 (?ohrR), ?CV_1776, ?CV_1810 e ?CV_2726, para a linhagem selvagem superexpressando CV_2726 e para a linhagem selvagem em estresse oxidativo com hidroperóxido de cumeno (CHP). O regulon do repressor CV_1810 compreendeu dois operons divergentes, que codificam enzimas que possivelmente metabolizam compostos aromáticos, mas produtos do catabolismo destes compostos não funcionaram como ligantes capazes de antagonizar a repressão de CV_1810 no gene CV_1801. O regulon do ativador CV_2726, definido como quatorze genes comuns diferencialmente expressos em ensaios na ausência e na condição de superexpressão do gene CV_2726, revelou poucos genes (cstA) com potencial de estar envolvidos no fenótipo de menor virulência do mutante ?CV_2726. Os reguladores CV_0577 e CV_1776 foram alocados na subfamília UrtR de resposta a urato e provavelmente influenciam a virulência de C. violaceum com regulons sobrepostos. O regulon de CV_1776 abrangeu dezenas de genes, muitos deles relacionados ao catabolismo de aminoácidos, mas há poucos candidatos a fatores de 10 virulência clássicos (pecM, escU). Alguns genes do catabolismo/utilização de purinas (CV_0578 e CV_3771) foram regulados tanto por CV_1776 quanto por CV_0577 e responderam a presença de urato. O perfil transcricional da resposta adaptativa de C. violaceum a CHP, um ligante que oxida o regulador OhrR, revelou aumento na expressão de genes relacionados à detoxificação de peróxidos (enzimas antioxidantes e sistemas redutores de tiol), degradação da porção aromática do CHP (oxigenases) e proteção contra estresses secundários (reparo de DNA, choque térmico, limitação de ferro e nitrogênio). O regulon de OhrR revelou-se pequeno, incluindo dois genes com expressão aumentada, CV_0209 (ohrA) e CV_0208 (possível diguanilato ciclase), e três genes com expressão diminuída (hemolisina, quitinase e colagenase) no mutante ?ohrR. Assim, a virulência atenuada do mutante ?ohrR deve estar relacionada ao aumento da produção do segundo mensageiro cíclico di-GMP (c-diGMP) e à diminuição da expressão de enzimas degradativas extracelulares. Em conclusão, definimos a resposta transcricional à CHP, identificamos potenciais fatores de virulência, como a diguanilato ciclase, no regulon OhrR, e mostramos que C. violaceum utiliza os fatores de transcrição da família MarR CV_0577, CV_1776, CV_2726 e OhrR para modular sua virulência. / Transcription factors belonging to the MarR family act as direct intracellular sensors of signals and control many processes in bacteria, including virulence and degradation of aromatic compounds. In this work, we identify and characterize MarR family transcription factors controlling virulence in Chromobacterium violaceum, an opportunistic pathogen of humans. Using allelic exchange mutagenesis, we generate non-polar null mutants for twelve of the fifteen MarR family regulators found in the C. violaceum genome. In virulence tests, when introduced by intraperitoneal injection in BALB/c mice, the ?CV_0210 (?ohrR), ?CV_0577 and ?CV_2726 mutant strains were less virulent, while the ?CV_1776 was more virulent, when compared to the wild-type strain. The other nine MarR mutants showed no difference in virulence tests. To define the regulon of some MarR family transcription factors, the gene expression profiles were determined by DNA microarray analysis and Northern blot assays for the ?CV_0210 (?ohrR), ?CV_1776, ?CV_1810 and ?CV_2726 mutant strains, for the wild-type strain overexpressing CV_2726 and for the wild-type strain exposed to oxidative stress generated by cumene hydroperoxide (CHP). The CV_1810 is a repressor of a regulon that comprised two divergent operons encoding enzymes that possibly metabolize aromatic compounds, but catabolic products of these compounds did not function as ligands capable of antagonizing the repression of CV_1810 on the CV_1801 gene. The regulon of the activator CV_2726, defined as fourteen differentially expressed genes commonly found in assays in the absence and overexpression of the CV_2726 gene, revealed few genes (cstA) with potential to be involved in the phenotype of lower virulence of the ?CV_2726 mutant strain. Regulators CV_0577 and CV_1776 were allocated in the urate-responsive UrtR subfamily and probably afect the virulence of C. violaceum with overlapping regulons. The CV_1776 regulon contains dozens of genes, many of them related to amino acid catabolism, but there are few candidates for classical virulence factors (pecM, escU). Some genes related to catabolism/utilization of purine (CV_0578 and CV_3771) were 12 regulated by both CV_1776 and CV_0577 and responded to the presence of urate. The transcriptional profile of the adaptive response of C. violaceum to CHP, a ligand that oxidizes the OhrR regulator, revealed the upregulation of genes related to the detoxification of peroxides (antioxidant enzymes and thiol-reducing systems), degradation of the aromatic moiety of CHP (oxygenases), and protection against other secondary stresses (DNA repair, heat shock, iron limitation, and nitrogen starvation responses). The OhrR regulon was shown to be small, including two upregulated genes, CV_0209 (ohrA) and CV_0208 (putative diguanylate cyclase), and three downregulated genes (hemolysin, chitinase, and collagenase) in the ?ohrR mutant. Thus, the attenuated virulence of the ?ohrR mutant might be related to the increased production of the second messenger cyclic di-GMP (c-di-GMP) and the decreased expression of extracellular enzymes required for tissue dissemination, in this mutant strain. In conclusion, we have defined the transcriptional response to CHP, identified potential virulence factors such as diguanylate cyclase as members of the OhrR regulon, and shown that C. violaceum uses the transcription factors of the MarR family CV_0577, CV_1776, CV_2726 and OhrR to modulate its virulence.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-13092018-104909 |
| Date | 13 June 2018 |
| Creators | Mello, Maristela Previato |
| Contributors | Silva Neto, José Freire da |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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