Diabetes mellitus (DM) ist eine Stoffwechselerkrankung, die durch eine chronische Hyperglykämie (erhöhter Blutzuckerspiegel) gekennzeichnet ist. Derzeit leiden mehr als 540 Millionen Menschen, die überwiegend in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen leben, an Diabetes, und es wird prognostiziert, dass die Inzidenzrate bis 2045 auf über 783 Millionen ansteigen wird, was auf eine große Krise im öffentlichen Gesundheitswesen hindeutet. Typ-1-Diabetes (T1D), eine chronische Autoimmunerkrankung, entsteht durch die von T-Zellen vermittelte Zerstörung der insulinproduzierenden β-Zellen in den Pankreasinseln, wodurch der Blutzuckerspiegel der Patienten nur unzureichend kontrolliert wird. T1D ist eine der häufigsten endokrinen und metabolischen Störungen im Kindesalter, und die Behandlungsmöglichkeiten umfassen die Verabreichung verschiedener Formen von exogenem Insulin durch unterschiedliche Modalitäten. Inseltransplantationen oder Transplantationen der gesamten Bauchspeicheldrüse sind nach wie vor die Standardtherapien, aber die Organknappheit stellt eine erhebliche Einschränkung dar. Als Alternative bieten sich humane pluripotente Stammzellen (hPSCs) für eine Diabetes- Zellersatztherapie an, aber die erzeugten inselähnlichen Cluster (SC-Inseln) sind funktionell noch nicht ausgereift. Zahlreiche Bemühungen, den Differenzierungsprozess zu verbessern, haben erhebliche Fortschritte gezeigt, aber die Herausforderungen in Bezug auf Effizienz, Funktionalität und Reifung bleiben bestehen. Ich stellte die Hypothese auf, dass (a) die Heterogenität von hPSC-abgeleiteten Pankreasvorläuferzellen (PPs) und (b) ihre Expansion sowie (c) die Förderung der Gefäßentwicklung in den SC-Inseln die β-Zellreifung und die geringe Umwandlungseffizienz von hPSCs in β-Zellen verbessern könnten. Um der Heterogenität der PP entgegenzuwirken, habe ich zunächst das Verfahren zur Differenzierung von hPSCs zu β-Zellen überarbeitet und dabei einen sehr hohen Anteil von 80-90% PDX1+/SOX9+/NKX6.1+ Zellen im PP-Stadium erreicht. Außerdem habe ich ein GMP-konformes, kostengünstiges und effizientes Expansionsverfahren verfeinert und vollständig etabliert, das eine konsistente exponentielle Expansion von PP-Zellen um das 2000-fache über 40 Tage ermöglicht. Bemerkenswerterweise kann dieses Verfahren die Anreicherung von expandierten PPs (ePPs) auf bis zu 80-90% PDX1+/SOX9+/NKX6.1+ Zellen vermitteln. Wichtig ist, dass ePPs mit ähnlicher Effizienz wie nicht-expandierte PP- Zellen in SC-Inseln mit funktionellen β-Zellen differenziert werden können.
Ich stellte dann die Hypothese auf, dass die Einbeziehung sowohl von Endothelzellen (ECs) als auch von Perizyten (PCs) während der Differenzierung von PP-Zellen in einem Prozess, den ich als Tri-Kultur bezeichnete, die In-vivo-Entwicklung besser nachahmen und zu einer effizienten Differenzierung und Reifung von SC-Inseln führen würde. Um diese Hypothese der Vaskularisierung von SC-Inseln zu untersuchen, habe ich erfolgreich Verfahren zur gleichzeitigen Erzeugung von hochreinen (>95%) ECs und PCs etabliert, indem ich veröffentlichte Verfahren anpasste und modifizierte. So konnte ich sowohl PP-Zellen als auch vaskuläre Zellen aus derselben hPSC-Linie erzeugen. Im nächsten Schritt ermittelte ich das geeignete Zellverhältnis bei der gemeinsamen Ansammlung von PP-Zellen mit ECs und PCs sowie die geeignete Medienzusammensetzung, die das Überleben und die gemeinsame Entwicklung aller drei Zelltypen während S5-S7 ermöglichte. In den daraus resultierenden 'vaskularisierten' SC-Inseln (vSC-Inseln) waren die vaskulären Zellen gleichmäßig über die SC-Insel verteilt, was tatsächlich auf die Möglichkeit der Bildung von Mikrovaskulatur hindeutet. Die starke Expression endokriner Marker wurde beibehalten und die funktionelle Kompetenz der β-Zellen in den vSC-Inseln schien verbessert, was auf die potenziellen Vorteile der Vaskularisierung bei der Förderung der Inselfunktionalität hinweist. Die Entwicklung dieser vSC-Inseln ist ein wichtiger Schritt zur korrekten Modellierung der Inselentwicklung und eröffnet spannende Möglichkeiten zur Förderung der endokrinen Zellreifung in vitro sowie ihrer Integration nach der transplantation.:Summary ii
Zusammenfassung iv
Acknowledgements x
List of Figures xii
List of tables xiv
List of abbreviations xv
1 INTRODUCTION 1
1.1 Classification and pathogenesis of diabetes 1
1.1.1 Type 1 Diabetes 2
1.1.2 Complications and challenges arising from diabetes 8
1.1.3 Approaches to address diabetes 9
1.1.4 Available therapeutic options and their constraints 12
1.2 Gastrulation 14
1.2.1 Patterning and germ layer specification in mammalian embryo 15
1.2.2 Patterning of the developing endoderm and gut tube formation 17
1.2.3 Emergence of alternative (hepatic and gut) lineages instead of pancreatic fate determination 19
1.2.4 Initiation of Pancreatic Fate and Morphogenesis 20
1.2.5 Primary transition 21
1.2.6 Secondary transition 23
1.2.7 Tertiary transition 27
1.2.8 Maturation of murine α and β cells during development 27
1.2.9 Differences in the developmental processes between humans and mice 28
1.2.10 Role of vasculature in islet development 30
1.3 Stem cells and their types: 33
1.3.1 Pluripotent stem cells: a promising source for β-cell replacement therapy 33
1.3.2 A long journey of hPSC towards generating β-cells 35
1.3.3 Significant differentiation protocols since last decade 37
1.3.4 Implementation of Stem cell therapies for T1D 41
1.3.5 Present status; clinical trials for the treatment of T1D, past and present 43
2 Material and methods 45
2.1 Cell culture 45
2.1.1 Coating of a matrix for the cell culture 45
2.1.2 Passaging of hESC cells 45
2.1.3 Freezing of and thawing of hPSCs 45
2.1.4 Freezing and thawing of PPs, ECs and PCs: 46
2.2 Differentiation of hPSCs to SC-islets using the Gavalas lab protocol 47
2.2.1 Seeding of hPSCs for PP differentiation 47
2.3 Expansion of PPs 49
2.4 Differentiation of hESCs into vascular cells 50
2.4.1 Differentiation of hESCs into ECS using ETV2 inducible line 50
2.4.2 Simultaneous differentiation of hESCs to ECs and PCs 50
2.5 RNA extraction, cDNA synthesis and RT-qPCR 51
2.5.1 RNA extraction 51
2.5.2 cDNA synthesis 52
2.5.3 RT-qPCR 52
2.6 Immunofluorescence analyses of monolayers cells, cryosections, and whole mounts 52
2.7 Flow cytometry (FC) of fixed (nuclear and surface markers) and live cells 54
2.8 Functionality assay for SC-islets 56
2.8.1 Static glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) assay 56
2.8.2 C-peptide ELISA kit detection 56
2.9 Live Ca2+ imaging 57
2.10 Automated confocal imaging and analysis 57
2.11 Statistical analysis and graphs 57
3 Generation of SC-islets from hPSCs 58
3.1 hPSCs retained their pluripotency before the start of differentiation 58
3.2 Optimal seeding density is key to the successful differentiation 59
3.3 Efficient generation of definitive endoderm (DE) cells (S1) 60
3.4 Successful differentiation of DE cells into primitive gut tube (PGT) and posterior foregut (PF) 61
3.5 Generation of PDX1+/SOX9+/NKX6.1+ enriched PP population (S4) 64
3.6 Stagewise transcriptomic analysis of hPSCs to PP differentiation 66
3.7 PP cells differentiated into pancreatic endocrine progenitor (PEP) (S5) cells 68
3.8 Generation of SC-islets containing functional β cells 69
3.9 Inclusion of N21 in S7 increases INS expression, numbers of β-cells and β-cell responsiveness 71
4 Expansion of PPs under GMP-compatible condition 74
4.1 C6 expansion selects PDX1+/SOX9+/NKX6-1+ cells population across lines 74
4.2 GMP-compliant C6 shows similar growth kinetics in all three lines while maintaining chromosomal stability 77
4.3 The transcriptome of ePPs revealed their stabilization just after five passages 78
4.4 C6 promoted strong upregulation of GP2, a pancreatic progenitor marker, during expansion 79
4.5 Impact of expansion on progenitor transcription factors and ductal program activation 80
4.6 Expansion with C6 represses the endocrine program and alternative lineages 82
4.7 C6 ePPs differentiate into SC-islets containing functional β-cells 83
5 Generation of SC-islets containing endothelial cells and pericytes 85
5.1 The ETV2 inducible expression hPSC line 85
5.2 Efficient differentiation of hPSCs to ECs using the ETV2 inducible expression line 86
5.3 Co-culturing PPs with ECs till S7 89
5.4 Simultaneous generation of PCs and ECs from hPSCs 90
5.5 ECs and PCs can be expanded for three passages with similar efficiency in four different matrices 92
6 Discussion 101
7 Future outlook 110
8 Supplementary information 112
9 Bibliography 121
10 Anlage 1 144
11 Anlage 2 145
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:90940 |
| Date | 01 July 2024 |
| Creators | Bandral, Manuj |
| Contributors | Gavalas, Anthony, Ludwig, Barbara, Technische Universität Dresden |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | English |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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