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Previous issue date: 2018-03-26 / The Paullinia cupana var. sorbilis, popularly known as guarana, is one of the most
promising compounds in Brazilian flora. The presence of methylxanthines (caffeine,
theophylline and theobromine) and tannins (caffeine and catechin) in its composition
make it a potent therapeutic compound. Stimulant, antifungal, antimicrobial,
antiparasitic activities, among others, are described in the literature as potentiality of
this compound. On the other hand, when the product is exposed to high temperatures, in
the presence of moisture, oxygen and in direct contact with light or, when stored in
inadequate packaging, the integrity of the active ingredient may be impaired and
consequently, the decrease and/or loss of activity and onset of toxicity can be observed.
With the intent of obtaining a more stable, effective and safe product, the objective of
this work was to prepare and characterize a liposomal system containing guarana
powder and to evaluate its safety "in vitro" through a study of cytotoxicity and
genotoxicity. First, analytical methods for the quantification of markers present in
guarana were developed and validated by ultraviolet derivative (UVD), for caffeine and
catechin, and by high performance liquid chromatography (HPLC), for quantification of
caffeine, theophylline, theobromine, catechin and epicatechin in samples of guarana
powder and liposomes. The methods developed proved to be linear, specific, precise,
accurate and robust for the simultaneous determination of the different markers in the
guarana powder sample and in the liposomes. Through the forced degradation study it
can be observed, in general, a reduction of polyphenols content (catechin and
epicatechin), compared to basic (0.1 M NaOH) and photolytic (fluorescence UVC)
conditions, both for the standards and for guarana and for liposomes. For the latter, a
reduction in the content of active compounds was also observed against oxidative
conditions (3% H2O2). It is believed that this change is related to the process of
epimerization and photostability, already described for polyphenols when in contact
with basic and photolytic solutions, respectively. After conducting a preformulation
study it was observed that liposomes containing 1 mg.mL-1 guarana powder, prepared
by the reverse phase evaporation method and the ethanol injection method presented
adequate characteristics and remained more stable in relation to the formulations
containing 10 and 5 mg.ml-1. After the physical-chemical characterization and stability
study of these formulations, the reverse phase evaporation method was chosen as the
best method for encapsulation of guarana. These systems remained stable under
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refrigeration without significantly modifying their characteristics for 60 days. A
toxicological evaluation of liposomes in different cell cultures (3T3, HaCaT, A549,
HepG2 and THP1) and in different concentrations (3.91-500 μg.mL-1) showed that, in
general, the liposomes do not present significant toxicity up to a concentration of 125
μg.mL-1 when analyzed by the neutral red technique (NRU). By the (3-(4,5-
Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) technique (MTT), the viability
reduction was observed from the concentration of 31.25 μg.mL-1 for the 3T3 and
HepG2 cells and 62.5 μg.mL-1 for the A549 cell. Hemolysis, photohaemolysis, and
hemoglobin oxidation tests showed that the liposomes, in the absence of guarana,
caused damage to the eritrocytes and that guarana can reverse and/or protect the cells
against this damage. It was also observed that this damage is possibly related to the
presence of polysorbate 80 present in the formulations. When chlorpromazine was
added to the experiments, it was observed that the guarana containing liposomes were
able to protect the cells from the damage caused by that compound. Through the
genotoxicity study it was possible to observe that guarana and liposomes did not cause
DNA damage. The evaluation of the antioxidant activity by the DPPH technique proved
the antioxidant effect, already described for guarana and, it was verified that this
activity was maintained after the incorporation of guarana in the liposomes. This
activity observed for all treatments was dose dependent of the concentration of guarana
in the formulation. In this way, we can conclude that it was possible to develop a
liposome system through the reverse phase evaporation method containing 1 mg.mL-1
of guarana powder, remaining stable for 60 days and showing safety against the
different cell types tested. It is also worth noting the importance of new experiments,
mainly the performance of the spray drying to improve the stability of the active
ingredients and the characterization of these new systems formed, as well as additional
tests regarding the safety profile. / A Paullinia cupana var. sorbilis, popularmente conhecida por guaraná é um dos
compostos mais promissores da flora brasileira. A presença de metilxantinas (cafeína,
teofilina e teobromina) e taninos (cafeína e catequina) em sua composição, fazem deste,
um potente composto terapêutico. Atividades estimulante, antifúngica, antimicrobiana,
antiparasitária, dentre outras, estão descritas na literatura como potencialidade deste
composto. Em contra partida, quando o produto encontra-se exposto a temperaturas
elevadas, na presença de umidade, oxigênio e em contato direto com a luz ou ainda,
quando conservado em embalagens inadequadas, a integridade dos ativos pode ser
prejudicada e consequentemente a diminuição e/ou perda da atividade e surgimento de
toxicidade podem ser observadas. Com a proposta de obter um produto mais estável,
eficaz e seguro, o objetivo deste trabalho foi preparar e caracterizar um sistema
lipossomal contendo pó de guaraná, além de avaliar a sua segurança “in vitro” através
de estudo de citotoxicidade e genotoxicidade. Primeiramente, métodos analíticos para
quantificação dos marcadores presentes no guaraná foram desenvolvidos e validados
por espectrofotometria ultravioleta derivada (UVD), para a cafeína e a catequina e por
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para quantificação de cafeína, teofilina,
teobromina, catequina e epicatequina em amostras de pó de guaraná e nos lipossomas.
Os métodos desenvolvidos demostraram-se lineares, específicos, precisos, exatos e
robustos para determinação simultânea dos diferentes marcadores em amostra de pó de
guaraná e nos lipossomas. Através do estudo de degradação forçada pode-se observar,
de forma geral, redução no teor dos polifenóis (catequina e epicatequina), frente a
condições básicas (NaOH 0,1 M) e fotolíticas (UVC fluorescentes), tanto para os
padrões, como para o guaraná e para os lipossomas. Para esse último, observou-se
também redução no teor dos compostos ativo frente a condições oxidativas (H2O2 3%).
Acredita-se que essa alteração esteja relacionada ao processo de epimerização e
fotoinstabilidade, já descrito para os polifenóis quando em contato com soluções básicas
e fotolíticas, respectivamente. Após a realização de um estudo de pré-formulação
observou-se que os lipossomas contendo 1 mg/mL de pó de guaraná, preparados pelo
método de evaporação em fase reversa e pelo método de injeção de etanol apresentaram
características adequadas e mantiveram-se mais estáveis em relação as formulações
contendo 10 e 5 mg/mL. Posteriormente a caracterização físico-química e o estudo de
estabilidade destas formulações, o método de evaporação em fase reversa foi escolhido
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como o melhor método para encapsulação do guaraná. Esses sistemas mantiveram-se
estáveis sobre refrigeração, sem modificar de forma significativa, das suas
características por 60 dias. A avaliação toxicológica dos lipossomas frente á diferentes
culturas celulares (3T3, HaCaT, A549, HepG2 e THP1) em diferentes concentrações
(3,91 – 500 μg/mL), mostrou que, de forma geral, os lipossomas não apresentam
toxicidade significativa até a concentração de 125 μg/mL quando analisados pela
técnica de vermelho neutro (NRU). Já pela técnica de brometo de 3-(4,5-dimetil-2-
tiazolil)-2, 5-difenil-2H-tetrazólio (MTT) a redução da viabilidade foi observada a partir
da concentração de 31,25 μg/mL para as células 3T3 e HepG2 e 62,5 μg/mL para a
célula A549. Os testes de hemólise, fotohemólise e oxidação da hemoglobina
mostraram que os lipossomas sem a presença do guaraná apresentaram dano aos
eritrócitos e que o guaraná consegue reverter e/ou proteger as células contra esse dano.
Observou-se também que esse dano, possivelmente esteja relacionado à presença do
polissorbato 80 presente nas formulações. Quando foi adicionado a clorpromazina aos
experimentos, observou-se que os lipossomas contendo guaraná conseguiram proteger
as células do dado provocado por esse composto. Pelo estudo de genotoxicidade foi
possível observar que o guaraná e os lipossomas contendo guaraná não ocasionaram
dano ao DNA. A avaliação da atividade antioxidante pela técnica de DPPH comprovou
o efeito antioxidante, já descrito para o guaraná, e ainda, verificou-se que essa atividade
foi mantida após a incorporação do guaraná nos lipossomas. Essa atividade observada
para todos os tratamentos foi dose dependente da concentração de guaraná na
formulação. Desta forma, podemos concluir que foi possível desenvolver um sistema
lipossomal através do método de evaporação em fase reversa contendo 1 mg/mL de pó
de guaraná, mantendo-se estável por 60 dias e mostrando-se seguro frente os diferentes
tipos celulares testados. Resalta-se ainda, a importância de novos experimentos,
principalmente a realização da secagem por aspersão para melhorar a estabilidade dos
ativos e a caracterização destes novos sistemas formados, além de testes adicionais
quanto ao perfil de segurança.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede.universidadefranciscana.edu.br:UFN-BDTD/657 |
| Date | 26 March 2018 |
| Creators | Roggia, Isabel |
| Contributors | Gomes, Patrícia, Ourique, Aline Ferreira, Vinardell, Maria Pilar, Colomé, Letícia Marques, Rodrigues, Oscar Endrigo Dorneles, Machado, Alencar Kolinski, Volkmer, Tiago Moreno |
| Publisher | Universidade Franciscana, Programa de Pós-Graduação em Nanociências, UFN, Brasil, Biociências e Nanomateriais |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional Universidade Franciscana, instname:Universidade Franciscana, instacron:UFN |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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