Diese Promotionsarbeit beschreibt die Anwendung und Entwicklung eines Mehrkanal-Sensors zur zeitaufgelösten Biofilmbildungsdetektion und -überwachung. Biofilme, bestehend aus an Oberflächen gebundenen Gemeinschaften aus Mikroorganismen, findet man sowohl in technischen wasserfüh-renden Systemen, als auch im medizinischen Bereich. Dort sind sie als Verursacher von Biokorrosion, Biofouling, Kontaminationen und Infektionen meist unerwünscht. Reinigungs- und Desinfektionspro-zesse zur Entfernung dieser Biofilme erzeugen weltweit immense Kosten. Auf Grund von Forschungs-ergebnissen ist inzwischen bereits einiges über die Entwicklung und das Entstehen von Biofilmen an Modellorganismen bekannt. Viele Fragestellungen, besonders im Bereich der anwendungsbezogenen Detektion von Biofilmen, sind jedoch immer noch nicht gelöst, auch verursacht durch das Fehlen geeigneter Messmethoden. Sensoren, die es ermöglichen, Biofilmwachstum nicht-destruktiv online zu verfolgen, bieten im Gegensatz zu klassischen Methoden Vorteile unter anderem in der zeitlichen Auflösung und der Möglichkeit des Screenings. Derzeit gibt es lediglich wenige solcher Sensoren, die auch noch intrinsische Schwachpunkte aufweisen, wie beispielsweise eine geringe zeitliche Mess-dauer, einen geringen sensitiven Bereich, oder ein statisches Setup.
Ziel dieser Dissertation war es daher, einen solchen Sensor zu entwickeln, der es erlaubt, beginnend mit der Adhäsion der Mikroorganismen bis hin zur Langzeit-Reifung des Biofilms unter Ausbildung 3-dimensionaler Strukturen Biofilmwachstum online zu dokumentieren. Ausgehend von einem 2-Kanalprototypen wurde in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Bastian Rapp (früher KIT, Institut für Mikrostrukturtechnik; IMT) ein 48-Kanalbiofilmsensor, basierend auf den beiden elektrochemischen Techniken Impedanzspektroskopie und amperometrischer Messung, entwickelt. Die zunehmende Biomasse eines in einem Sensorkanal anwachsenden Biofilms wurde hierbei durch ein Ansteigen der Inhibition beim Landungstransfer zwischen einem Elektrodenpaar ermittelt. Paral-lel wurde die Aktivität der gebundenen Biomasse über den Elektronenfluss ausgehend von respirati-ons-aktiven oxidativen Prozessen gemessen. Die Verwendung von parallelen Mikrokanälen ermög-licht ein referenziertes, zeitaufgelöstes Screening, geeignet beispielsweise für die Evaluation und Optimierung von Behandlungsmethoden und Reinigungsstrategien für Biofilme, als auch für die Untersuchung von Biofilmen in der Grundlagenforschung.
Im Laufe dieser Arbeit wurde dieser neuentwickelte Mehrkanal-Sensor optimiert, validiert und an-gewendet. Die Optimierung, besonders in Bezug auf Sensitivität, erfolgte durch die Verwendung verschiedener Elektrodentypen der Amperometrie- und der Impedanz-Messung. Eine Kombination aus Interdigital- und zirkulärer Elektrode erlaubt letztendlich eine sensitive Impedanzmessung im Bereich weniger Stunden bis hin zu mehreren Wochen. Die Systemvalidierung erfolgte durch den Vergleich der Biofilmbildung von P. aeruginosa im Sensor zu klassischen mikrobiologischen Metho-den wie Fluoreszenz- oder Biomassenfärbung und zeigte die Eignung des Systems zur Verfolgung der Biofilmbiomasse und deren Aktivität.
Nach erfolgreicher Optimierung und Validierung wurde der Sensor auf verschiedenste Anwendungs-möglichkeiten hin getestet. Beispielsweise wurde der Sensor zur Detektion aller Biofilmstadien und der Wachstumscharakterisierung verschiedenster Gram-positiver und –negativer Bakterienspezies eingesetzt und zeigte seine Verwendbarkeit für beide Bakterien-Domänen. Zusätzlich bietet der Sensor ein geeignetes mikrobiologisches Werkzeug zur Grundlagenforschung, besonders in Kombi-nation mit sensorübergreifenden Analysemethoden wie Genexpressions- und Populationsanalysen. Gerade durch die kombinierten Anwendungen dieser Techniken mit der sensorbasierten Biofilmde-tektion konnte gezeigt werden, dass sich die Expression von Attachmentgenen zwischen P. aerugino-sa- und S. maltophilia-Stämmen deutlich unterscheidet. Es wurde ermittelt, dass eine Anhaftung von P. aeruginosa hauptsächlich durch Flagellen gesteuert wird, wohingegen S. maltophilia sich Fimbri-en-bedingt anlagert. Neben der Arbeit mit Modellorganismen wurde auch eine anwendungsbezogene Biofilmüberwachung von Abwasser- oder anaeroben Biofilmen mit Hilfe des Sensorsystems getestet und bestätigte dabei die vergleichsweise hohen bakteriellen Aktivitäten in anaeroben Systemen.
Des Weiteren wurden Biofilmmanipulations-Strategien basierend auf DNase, Antibiotika, Desinfekti-ons- und Reinigungsmitteln in Echtzeit untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Kombinatio-nen von EPS-Matrix-Destabilisierung und Biofilminaktivierung einen vielversprechenden Ansatz zur Biofilmentfernung darstellt. Eine alleinige Biofilm-Destabilisierung erwies sich jedoch als kritisch für ein nachfolgendes Wiederanwachsen eines Biofilms. Dies war besonders im Hinblick auf das Lang-zeitverhalten eines behandelten Biofilms relevant. Der hier entwickelte Sensor liefert zur Analyse dieses Wiederanwachsens optimale Möglichkeiten, da auch über einen längeren Zeitraum das Bio-filmbildungspotential in einer nicht-destruktiven Weise detektiert werden kann.
Zusammenfassend bietet der neuentwickelte Sensor nun eine Technologie, um tiefere Einblicke in das Verständnis von Biofilmbildung zu gewinnen und daraus neue Strategien zur gezielten Bio-filmmanipulation zu entwickeln und zu testen und damit hohe Kosten einzusparen. Mit diesem Po-tential kann der Sensor nun sowohl in der Wissenschaft als auch in der Industrie seinen Einsatz finden.:1. EINLEITUNG
1.1. BIOFILME
1.1.1. Vorkommen
1.1.2. Biofilmzyklus
1.1.3. Aufbau und Bestandteile
1.1.4. Biofilmmodellorganismen
Pseudomonas aeruginosa
Allgemein.
Biofilmbildung - Genexpression der Adhäsion und Motilität.
Stenotrophomonas maltophilia
Allgemein.
Biofilmbildung- Genexpression der Adhäsion und Motilität.
1.1.5. Biofilm-Manipulation
1.2. BIOFILMDETEKTION UND –MONITORING
1.2.1. Biofilmsensoren
1.2.2. Elektrochemische Impedanzspektroskopie
1.2.3. Amperometrie
1.3. ZIEL DER ARBEIT
2. MATERIAL UND METHODEN
2.1. MATERIAL
2.1.1. Chemikalien
2.1.2. Bakterien
2.1.3. Nährmedien, Puffer und Kits
Verwendete Kits
2.1.4. Geräte, Analyse-Software und Verbrauchsmaterialien
2.2. METHODEN
2.2.1. Biosensorfertigung
Elektrodenherstellung
Herstellung der mikrofluidischen Kanäle
Herstellung der amperometrischen Gegenelektrode
Impedanzspektrummessgerät
2.2.2. Mikrobiologische Methoden
Bakterien-Anzucht
Fluidische Biofilmbildung im Sensor
Allgemein.
Spezifische Parameter.
Abwasserbiofilme.
Anaerobe Biofilmanzucht im Sensor.
DNase Test fluidisch.
Kombinatorische Tests.
Statische Biofilmquantifizierung durch Kristall-Violett-Färbung
Allgemein.
Spezifisch.
DNase Test statisch
eDNA-Screening
eDNA-Färbung von Biofilmen
Lebend/Tot-Färbung von Biofilmen
Allgemein.
Motilitäts-tests
2.2.3. Molekularbiologische Methoden
Nachweis von spezifischen Genabschnitten mittels PCR
RNA-Isolierung und cDNA-Synthese
Genexpressionsanalyse durch PAGE
Genexpressionsanalyse durch qRT-PCR
DNA-Isolierung im Kanal
Populationsanalyse durch DGGE
Populationsanalyse mittels qPCR und DNA-Sequenzing
Bestimmung exoenzymatische Aktivität
2.2.4. Statistische Auswertung
3. ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Sensorprinzip
Sensor-Design
3.1. OPTIMIERUNG, VALIDIERUNG UND CHARAKTERISIERIUNG DES SENSORS
3.1.1. Amperometrischer Sensor
Optimierung
Validierung
3.1.2. Impedimetrischer Sensor
Optimierung
Frequenzauswahl
Validierung
Reproduzierbarkeit
3.1.3. Eignung für verschiedenste Medien und Bakterien
3.1.4. Fließeigenschaften
3.1.5. Zusammenfassung Sensoroptimierung, Validierung und Charakterisierung
3.2. SENSOR-ANWENDUNG
3.2.1. Komplexe Biofilme
Abwasserbiofilme
Anaerobe Biofilme
3.2.2. Biofilm-Manipulation
Abtötung von Biofilmen
Destabilisierung von Biofilmen
Destabilisierung durch Reinigungssubstanzen am Beispiel Tergazyme.
Enzymatische Destabilisierung am Beispiel DNase.
eDNA-Screening
eDNA-Menge in Relation zur DNase-Effizienz
eDNA-Lokalisierung
Zusammenfassung eDNA-Charakterisierung
Destabilisierung fluidischer Biofilme: Statische vs. fluidische DNase-Applikation
Wachstumsphasen-abhängige Destabilisierung
Kombinationatorische Ansätze
Tergazyme und Sterillium.
Stressen von Biofilmen
Zusammenfassung Biofilm-Manipulation
3.2.3. Stammcharakterisierung
Biofilmbildung von P. aeruginosa und S. maltophilia
Statisch vs. fluidisch.
Attachment- vs. Langzeitbiofilm.
Biofilmbildung vs. Genexpression Anlagerungs-Gene.
Biofilmbildung vs. Motilität.
Zusammenfassung Stammcharakterisierung
4. FAZIT
5. LITERATUR
DANKSAGUNG
6. ANHANG
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:74220 |
| Date | 22 March 2021 |
| Creators | Bruchmann, Julia |
| Contributors | Berendonk, Thomas, Schwartz, Thomas, Rapp, Bastian, Technische Universität Dresden |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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