El complejo de Golgi (Golgi) es un orgánulo dinámico que modifica proteínas y lípidos sintetizados en el retículo endoplasmático (RE) y los clasifica para enviarlos a su destino final. Está formado por un conjunto de cisternas aplanadas y apiladas (stack), con una región central plana y otra lateral dilatada. Cada stack está polarizado, con una cara cis, que es donde se recibe la carga sintetizada, y una cara trans, que es donde se le da salida. Adyacente a esta zona hay la red trans-Golgi o TGN, que es donde se producen las últimas modificaciones y se distribuye la carga para su transporte.
El Golgi interacciona con el citoesqueleto de actina y sus proteínas asociadas, ya que éstas se localizan en las membranas del Golgi tanto in vivo como in vitro. El ciotesqueleto de actina interviene en los procesos de fisión de membranas y en el mantenimiento de la estructura plana y contínua de las cisternas del Golgi. También está relacionado con el citoesqueleto de espectrina, una red submembranosa formada por la propia espectrina, la actina, la proteína 4.1, el intercambiador aniónico AE1 y la anquirina. Es responsable de la morfología de los eritrocitos, facilitando así su paso por los capilares. Se ha descrito un citoesqueleto de espectrina asociado al Golgi formado por varias isoformas como la βIII espectrina, la anquirina G119, el intercambiador aniónico AE2 y la proteína 4.1. No se sabe qué función realizan en el Golgi, pero se ha descrito que la espectrina está implicada en el transporte de la ATPasa Na+/K+ y del transportador de glutamato EAAT4.
Con estos antecedentes nos planteamos la siguiente hipótesis: la βIII espectrina y la anquirina G119 son necesarias para el mantenimiento de la organización estructural del Golgi y para el transporte secretor asociado. Para demostrarla nos planteamos determinar su localización en el Golgi y su participación en el mantenimiento de la estructura del orgánulo, examinar su papel en el transporte secretor y estudiar el elemento responsable de su localización en el Golgi.
Desarrollamos nuevos anticuerpos específicos contra la βIII espectrina y la anquirina G119 humanas pero sólo los de la βIII espectrina mostraban un marcaje en el Golgi. Por ello decidimos centrar todo el estudio en la βIII espectrina. Mediante estudios de colocalización con marcadores de las distintas regiones del Golgi determinamos que la βIII espectrina se encuentra enriquecida en los compartimentos distales (trans-Golgi y TGN). Mediante un ensayo enzimático que disminuía los niveles del fosfatidilinositol 4-fosfato [PI(4)P] del Golgi observamos que la localización de la βIII espectrina era dependiente de los niveles de este fosfoinosítido. Gracias a los ensayos de desplazamiento competitivo de la βIII espectrina determinamos que esta asociación era a través del dominio PH. También estudiamos la contribución de la dinámica de actina en la localización de la βIII espectrina mediante el uso de drogas anti-actina. La disrupción de la dinámica de actina no afecta a la localización de la βIII espectrina.
Para estudiar el papel de la βIII espectrina en la estructura del Golgi y el transporte secretor, silenciamos la βIII espectrina mediante ARNs de interferencia o la microinyección de anticuerpos anti-βIII espectrina. En ambos casos observamos una fragmentación del Golgi. Usando varios ensayos de transporte, observamos que el transporte en la zona RE/Golgi y en el post-Golgi (transporte anterógrado) de proteínas solubles y transmembrana está alterado en ausencia de βIII espectrina. Sin embargo, el transporte retrógrado de la subunidad B de la toxina de Shigella no está alterado.
Así pues, esta tesis expone que la βIII espectrina es el mayor componente esquelético de los compartimentos distales del Golgi, donde es necesaria para mantener la integridad estructural y la actividad secretora del Golgi, y que el PI(4)P es el determinante de membrana más relevante para la localización de la βIII espectrina. / A spectrin-based cytoskeleton is associated with endomembranes including the Golgi complex and cytoplasmic vesicles but its role remains poorly understood. Using new generated antibodies to specific peptide sequences of the human βIII spectrin, we here show its distribution in the Golgi complex, where it is enriched in the trans-Golgi and trans-Golgi network (TGN). The use of a drug-inducible enzymatic assay that deplete the Golgi-associated pool of PI4P as well as the expression of PH domains of Golgi proteins that specifically recognize this phosphoinositide both displaced βIII spectrin from the Golgi. However, the interference with actin dynamics using actin toxins did not affect the localization of βIII spectrin to Golgi membranes. Depletion of βIII spectrin using siRNA technology and the microinjection of anti-βIII spectrin antibodies into the cytoplasm lead to the fragmentation of the Golgi. At ultrastructural level, Golgi fragments showed swollen distal Golgi cisternae and vesicular structures. Using a variety of protein transport assays, we show that the ER-to-Golgi and post-Golgi protein transports were impaired in βIII spectrin-depleted cells. However, the internalization of the Shiga toxin subunit B to the ER was unaffected. We state that βIII spectrin constitutes a major skeletal component of distal Golgi compartments, where it is necessary to maintain its structural integrity and secretory activity, and unlike actin, PIP4 appears to be highly relevant for the association of βIII spectrin the Golgi complex.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UB/oai:www.tdx.cat:10803/107821 |
| Date | 13 December 2012 |
| Creators | Salcedo Sicilia, Laia |
| Contributors | Egea Guri, Gustavo, Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular, Immunologia i Neurociències |
| Publisher | Universitat de Barcelona |
| Source Sets | Universitat de Barcelona |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 237 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
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