En esta tesis se ha conseguido la caracterización bioquímica, biofísica y estructural del factor de transcripción mitocondrial A humano, TFAM.
TFAM presenta múltiples funciones en la biogénesis de la mitocondria y está implicada en transcripción, replicación, empaquetamiento del ADN mitocondrial, reparación del ADN mitocondrial.... Para tratar de hallar los mecanismos moleculares se procedió a la resolución de la estructura cristalográfica de TFAM en complejo con su secuencia diana de unión en el promotor LSP (Light Strand Promotor).
La estructura de TFAM en complejo con una secuencia de 22 pb de LSP (Rubio‐Cosials, Sidow et al.) mostraba cómo TFAM impone una torsión global del ADN de 180°, con ambos dominios HMGbox introduciendo un punto de curvatura mediante la unión al surco menor del ADN. Estudios en solución mediante SAXS (Small Angle Xray Scattering) de TFAM en forma no unida permitieron asignar un alto grado de flexibilidad para la región connectora entre los dominios HMGbox y la cola C‐terminal, ambas regiones cargadas positivamente. Esta flexibilidad de la zona connectora permite un gran número de conformaciones diferentes para TFAM en su forma libre, donde los dos dominios HMGbox se encuentran con posiciones relativas diferentes.
Posteriormente mediante estudios de spFRET (singleparticle FRET), se confirmó el sistema de curvatura del ADN definido por la estructura cristalográfica con la introducción de una torsión en éste en forma de U. Los estudios de SAXS y spFRET indicaban que esta unión presentaba un comportamiento ligeramente dinámico, posiblemente debido a la flexibilidad intrínseca que muestra la región connectora entre los dos dominios HMGbox en solución.
Los resultados obtenidos permiten entender la multitud de funciones asignadas a TFAM y en concreto, su papel en la activación de la transcripción a partir de LSP. / Transcription of human mitochondrial DNA requires transcription factor A (TFAM), also essential for DNA packaging and maintenance. Crystallographic analysis of TFAM in complex with an oligonucleotide encoding the light‐strand promoter (LSP) revealed for the first time a protein structure comprising two high‐mobility group (HMG) domains, which intercalate residues at two inverted DNA motifs and induce an overall DNA bend of ~180º stabilized by the inter‐domain linker. The U‐turn allows the TFAM C‐terminal tail, which recruits the transcription machinery, to approach the initiation site despite contacting a distant DNA sequence. We also show that structured protein regions contacting DNA in the crystal show high flexibility in solution, whereas both HMG domains have different DNA recognition capability. Our data suggest that TFAM bends LSP stepwise to create an optimal DNA conformation for transcriptional initiation, whilst facilitating DNA compaction elsewhere in the genome.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UB/oai:www.tdx.cat:10803/107935 |
| Date | 22 February 2013 |
| Creators | Rubio Cosials, Anna |
| Contributors | Solà Vilarrubias, Maria, Badia Palacín, Josefa, Universitat de Barcelona. Facultat de Farmàcia |
| Publisher | Universitat de Barcelona |
| Source Sets | Universitat de Barcelona |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 323 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
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