Les deplecions de DNA mitocondrial (mtDNA) i les alteracions de NFU1 són dos grups
de malalties que afecten vies molt importants dins de la mitocòndria i que alteren el
metabolisme energètic.
Clínicament, els pacients afectes de depleció de mtDNA es caracteritzen per mostrar
un ampli ventall de símptomes, depenent del gen afectat. Els símptomes clínics són
molt greus i la majoria de vegades porten a la mort del pacient. Els pacients amb
mutacions en el gen NFU1, descrits per primera vegada en aquest treball, presenten
una clínica més homogènia, caracteritzada sobretot per presentar una encefalopatia
infantil fatal i/o hipertensió pulmonar i un fenotip bioquímic molt particular però ben
definit, caracteritzat principalment per presentar acidosi làctica, hiperglicinèmia i
deficiència de l’activitat piruvat deshidrogenasa.
L’objectiu principal d’aquesta tesis ha consistit en millorar i implementar metodologies
per a contribuir al diagnòstic, i millorar la comprensió de la fisiopatologia d’aquestes
deficiències.
Per a tal fita s’ha posat a punt una tècnica de PCR a temps real per estudiar el número
de còpies de mtDNA i poder relacionar-lo amb l’activitat citrat sintasa. A més, la
depleció s’ha pogut estudiar en biòpsies incloses en parafina, una important font de
material biològic arxivat mai utilitzat fins al moment.
D’aquesta forma s’han pogut estudiat 50 pacients amb sospita clínica de depleció de
mtDNA i cercar mutacions en els gens relacionats; DGUOK, MPV17, C10orf2, SUCLG1,
SUCLA2 i POLG. L’estudi molecular ens ha permès identificar 4 mutacions no descrites
prèviament, c.70+5G>A en el gen MPV17, c.1048G>A i c.1049G>T en el gen SUCLA2, i
c.531+4A>T en el gen SUCLG1. A més s’han identificat 7 mutacions prèviament
descrites en un total de 10 pacients (8 famílies). Quan va ser possible, es va quantificar
el ràtio mtDNA/nDNA i la activitat citrat sintasa en la mateixa mostra de teixit, proveint
noves dades per l’estudi de les MDS. La depleció relacionada amb la citrat sintasa,
(mtDNA/nDNA)/CS, ha donat resposta a certes discrepàncies observades entre els
resultats de depleció i els resultats de la cadena respiratòria mitocondrial en alguns
pacients.
Per altra banda, utilitzant el mapatge per homozigositat, es va identificar una mutació
de canvi de sentit en homozigositat en el gen NFU1 (c.622G>T, p.Gly208Cys), que
codifica per una proteïna altament conservada en totes les espècies i que està implicada en la biogènesis dels clústers de sulfur de ferro (Fe-S). Aquesta ha esta la
primera vegada que s’ha associat mutacions en aquest gen a patologia humana.
El fenotip bioquímic dels pacients suggeria una activitat deficient de l’enzima lipoic
àcid sintasa (LAS), una proteïna que necessita clústers de Fe-S com a cofactor. Es va
poder constatar una disminució del grau de lipoilació de les proteïnes dependents
d’àcid lipoic, el que suggeria una manca d’ activitat LAS. Utilitzant models cel·lulars
hem demostrat que la proteïna NFU1 és necessària com a donadora de sulfur per la
biosíntesi d’àcid lipoic i també ens ha permès conèixer la funció específica en la
biosíntesi dels clústers de Fe-S i en la maduració de proteïnes Fe-S, concretament LAS i
la succinat deshidrogenasa (SDH).
La descripció clínica, bioquímica y genètica d’aquesta malaltia és molt important pel
diagnòstic de nous pacients i obre les portes a la cerca d’altres gens implicats en la
biosíntesi de l’àcid lipoic, així com al disseny futur de noves estratègies terapèutiques. / Mitochondrial DNA (mtDNA) depletion syndromes (MDS) and NFU1 defects are two
groups of diseases affecting crucial mitochondrial pathways of energetic metabolism.
Clinically, patients affected of mtDNA depletion displayed a wide range of symptoms,
depending on the altered gene. The clinical symptoms are severe and in most cases
lead to death of the patient. Patients with NFU1 mutations, described for the first time
in this paper, present a more homogeneous clinical phenotype, characterized by fatal
infantile encephalopathy and / or pulmonary hypertension. NFU1 patients also showed
a peculiar, but well defined, biochemical phenotype, presenting with lactic acidosis,
hyperglycinemia and deficiency of pyruvate dehydrogenase activity.
The main objective of the present thesis is to improve and to implement new methods
for the diagnosis and understanding of the pathophysiology of these deficiencies.
To this goal, a real-time PCR technique has been developed to study the mtDNA copy
number and its relationship to citrate synthase activity in MDS patients. In addition,
mtDNA depletion has been studied in formalin-fixed paraffin-embedded tissues, an
important source of biological material never used for this purpose.
We studied 50 paediatric individuals suspected to have mtDNA depletion and the
appropriate MDS genes have been screened according to their clinical and biochemical
phenotypes. Mutational study of DGUOK, MPV17, SUCLA2, SUCLG1 and POLG allowed
us to identify 4 novel mutations; c.70+5G>A in MPV17, c.1048G>A and c.1049G>T in
SUCLA2 and c.531+4A>T in SUCLG1, and 7 already known mutations in 10 patients (8
families).
When possible, we quantified mtDNA/nDNA and CS activity in the same tissue sample,
providing an additional tool for the study of MDS. The ratio (mtDNA/nDNA)/CS has
shed some light in the discrepant results between the mtDNA copy number and the
enzymatic respiratory chain activities of some cases.
Using homozigosity mapping, we identified a homozygous missense mutation in NFU1
gene (c.622G> T, p.Gly208Cys), which encodes a conserved protein suggested to
participate in Fe-S cluster biogenesis. This is the first time that a clinical phenotype has
been associated with mutations to NFU1.
The biochemical phenotype suggested an impaired activity of the Fe-S enzyme lipoic
acid synthase (LAS), a protein that requires Fe-S cluster as a cofactor. Direct measurement of protein-bound lipoic acid in individual tissues indeed showed marked
decreases, which suggested a lack of LAS activity.
Human cell models studies showed that NFU1 protein is required as sulfur donor for
the biosynthesis of lipoic acid and it performs a specific function in mitochondrial Fe-S
proteins maturation, particularly succinate dehydrogenase and LAS (SDH).
Clinical, biochemical and genetic description of NFU1 disease is very important for the
diagnosis of new patients and will allow us to find other genes involved in the
biosynthesis of lipoic acid, and provided the basis for the future design of new
therapeutic strategies.
Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UAB/oai:www.tdx.cat:10803/117464 |
Date | 19 December 2012 |
Creators | Navarro Sastre, Aleix |
Contributors | Ribes Rubió, Maria Antònia, González-Sastre, Francesc, Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular |
Publisher | Universitat Autònoma de Barcelona |
Source Sets | Universitat Autònoma de Barcelona |
Language | Catalan |
Detected Language | English |
Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
Format | 202 p., application/pdf |
Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
Rights | ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs., info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.002 seconds