L’activitat Pkh resulta essencial pel creixement vegetatiu del llevat Saccharomyces cerevisiae i es proporcionada principalment per Pkh1 i Pkh2. Es desconeixen però, en gran mesura, tant la totalitat de les seves funcions cel·lulars com els mecanismes de regulació.
Amb l’objectiu d’estudiar les funcions de les proteïnes Pkh en llevat, els diferents grups d’investigació han utilitzat fins a dia d’avui una única aproximació consistent en l’eliminació del gen PKH2 i la substitució de PKH1 per una versió que codifica una proteïna l’activitat de la qual resulta suprimida a 37 ºC. L’ús d’aquesta estratègia implica un estrès tèrmic per les cèl·lules de llevat, les quals responen activant la via de la CWI, on es troba implicada la via Pkh-Pkc1-MAPK. És per aquesta raó que en aquest treball s’ha utilitzat una estratègia diferent, desenvolupada al laboratori, la qual consisteix en l’obtenció d’una soca mutant en la que se li han suprimit els gens PKH1 i PKH3 i en la que s’ha col·locat un promotor regulable per doxiciclina que controla l’expressió de PKH2. Gràcies a aquesta soca hem pogut verificar per primera vegada que les proteïnes Pkh són necessàries per la fosforilació de Slt2 en front a diversos estressos de paret cel·lular.
A més, s’han estudiat els canvis a nivell transcripcional provocats per la manca de les proteïnes Pkh, revelant que es produeix una resposta característica d’una situació d’estrès oxidatiu. En efecte, les cèl·lules sense activitat Pkh acumulen més ROS i aquest fet va acompanyat d’un procés de mort cel·lular programada independent de la metacaspasa del llevat Mca1, segons els anàlisis de TUNEL que s’han realitzat. Els fenotips d’estrès oxidatiu i mort cel·lular es veuen disminuïts en part, per l’activació de la via MAPK de Slt2 mitjançant l’expressió d’una versió constitutivament activa de la MAPKK Bck1 .
Quelcom que afegeix complexitat a la regulació d’aquesta família de cinases, és el fet que alguns esfingolípids de cadena llarga o esfingolípids complexos de llevat, podrien regular la via de senyalització de Pkh1. Es coneix que les proteïnes Pkh tenen, a diferència de PDK1, un domini C-terminal molt més extens, de funció desconeguda, sense el domini PH, essencial per la unió de PtdIns(3,4,5)P3 en mamífers (que no sintetitza el llevat). Amb l’objectiu d’estudiar-ne la funcionalitat, s’han generat soques haploides on l’única activitat Pkh ve proporcionada per un plasmidi que porta la versió sencera de Pkh1 o bé una versió sense el domini C-terminal.
Gràcies a aquestes soques hem identificat l’esfingolípid sulfàtid, no descrit en llevats, capaç d’unir-se específicament als últims 100 aa del domini no catalític de Pkh1. Aquest fet ens ha portat a estudiar el lipidoma del llevat, el qual s’ha separat per la tècnica de HPTLC, que ens ha permès identificar una fracció polar del lipidoma que s’uneix a Pkh1. A més hem determinat que el domini C-terminal de Pkh1 és responsable de la sensibilitat als inhibidors de la síntesis dels esfingolípids, indicant així que els esfingolípids podrien tenir un paper en l’activació de les proteïnes Pkh. A partir d’un assaig cinasa fet amb liposomes que contenen sulfàtid, hem vist que la unió amb sulfàtid té una efecte negatiu sobre la capacitat de Pkh1 de fosforilar el substrat PKBΔPH, a diferència de l’assaig realitzat amb liposomes que contenen la fracció polar del lipidoma, que no en modifiquen l’activitat. / Pkh activity is essential for vegetative growth of yeast Saccharomyces cerevisiae and is mainly provided by Pkh1 and Pkh2. However, it is still largely unknown the set of cellular functions and the regulatory mechanisms of Pkh.
With the aim of studying the functions of Pkh proteins in yeast, different research groups have used the approach consisting in the deletion of the gene PKH2 and replacement of PKH1 by a protein version whose activity is suppressed at 37 ºC. The use of this strategy involves a heat stress for yeast cells and, consequently, activation of the CWI pathway, where the Pkh-Pkc1-Slt2 MAPK pathway is involved. For this reason we have used a different strategy, developed in the laboratory, for this study, consisting in generate a mutant strain where PKH1 and PKH3 genes were deleted and PKH2 was placed under control of doxycycline-repressed promoter. The use of this strain allowed us to verify, for the first time, that Pkh proteins are required for the phosphorylation of Slt2 in response to several cell wall stresses.
We have also studied the transcriptional changes caused by lack of Pkh proteins, revealing that there is a response similar to that induced by oxidative stress. Indeed, cells without Pkh activity accumulate ROS and this was accompanied by a process of programmed cell death that was independent of the yeast metacaspasa Mca1, according to performed TUNEL analysis. The phenotypes of oxidative stress and cell death were attenuated, at least in part, by the activation of the Slt2 MAPK by expression of a constitutively active version of MAPKK Bck1.
An element that adds complexity to the regulation of this kinases family is that long-chain sphingolipids, or yeast complex sphingolipids, could regulate Pkh1 signaling pathway. It is known that Pkh proteins, unlike mammalian PDK1, have a larger C-terminal domain of unknown function that apparently lacks a PH domain, which is essential for the binding of PDK1 to PtdIns(3,4,5)P3 (a lipid that is not synthesized in yeast). In order to study the functions of this domain, we have generated haploid strains where the only Pkh activity is provided by a plasmid, which carries either the full Pkh1 or a version without its C-terminal domain.
With these strains, we have identified a sphingolipid sulfatide, not described in yeast, able to specifically bind to the last 100 aa of the non- catalytic domain of Pkh1. This has led us to study the yeast lipidome, which was separated by HPTLC technique, allowing us to identify a polar fraction that binds to Pkh1. In addition, we determined that the C-terminal domain is responsible for sensitivity to inhibitors of sphingolipid synthesis pathway, indicating that sphingolipids may play a role in the activation of Pkh proteins. Pkh1 kinase assay with liposomes containing sulfatide indicated that binding of Pkh1 to the sulfatide has a negative effect on the Pkh1 activity when PKBΔPH was used as a substrate. In contrast, liposomes containing the polar lipidome fraction did not alter the Pkh1 activity.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UAB/oai:www.tdx.cat:10803/129117 |
| Date | 15 November 2013 |
| Creators | Bahí Salavedra, Anna |
| Contributors | Casamayor Gracia, Antonio, Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular |
| Publisher | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Source Sets | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Language | Catalan |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 260 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
Page generated in 0.0031 seconds