La identificación de interacciones proteína-proteína en las células resulta de gran importancia para entender los procesos biológicos a nivel molecular. Así, cada vez despierta mayor interés el estudio de las proteínas, no de manera individual sino a través de las interacciones que establecen con otras proteínas o biomoléculas ya que estas asociaciones son fundamentales para el desarrollo de las funciones celulares. En este sentido, una gran parte de este trabajo se ha dirigido a la aplicación de metodologías que permiten identificar y evaluar interacciones proteína-proteína, con la finalidad de asignar nuevas funciones a la enzima gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH) en E. coli.
Estudios realizados en humanos muestran que GAPDH es una proteína multifuncional, implicada en diversos procesos celulares. Las diferentes funciones dependen de su localización subcelular, estado oligomérico o interacciones con otras proteínas o ligandos. Sin embargo en bacterias, funciones alternativas a la glicólisis sólo se han descrito para la GAPDH secretada al medio extracelular por cepas patógenas y probióticas.
El objetivo de este trabajo es contribuir a la identificación de nuevas funciones de GAPDH en E. coli a nivel intracelular mediante el estudio de las interacciones que establece con otras proteínas. Mediante experimentos de cross-linking in vivo seguidos de inmunoprecipitación y análisis por espectrometría de masas se han identificado varias proteínas implicadas en distintos procesos celulares. A través de ensayos de Pull-down seguidos de Western Blot se ha validado la interacción de GAPDH con EF-Tu, piruvato quinasa, triptofanasa, fosfoglicolato fosfatasa (PGPasa) y las subunidades α y β de la ATP sintasa. La diversidad de proteínas identificadas sugiere que GAPDH, a través de múltiples interacciones, podría estar participando o modulando procesos metabólicos, de transporte, síntesis de proteínas, obtención de energía y reparación de DNA.
La implicación de GAPDH en procesos de reparación del DNA se ha evidenciado en estudios funcionales, utilizando células deficientes en esta proteína, en concreto mutantes knockout gapA o células silenciadas para la expresión del gen gapA mediante RNA antisentido. Se ha observado que estas células presentan una menor viabilidad que las control cuando son tratadas con agentes genotóxicos como bleomicina o metilmetanosulfonato. Además en el DNA genómico del mutante knockout gapA se observa un incremento en el número de centros abásicos generados de modo espontáneo. Mediante ensayos de Pull-down seguidos de Western Blot se ha evidenciado la interacción de GAPDH con proteínas que participan en los sistemas de reparación del DNA, como Endo IV del sistema de reparación por escisión de bases (BER) y SSB (single stranded DNA binding protein) implicada en los procesos de recombinación homóloga y en la respuesta SOS. Por último, las células deficientes en GAPDH (knockout y silenciadas) presentan morfología filamentosa en fase estacionaria de crecimiento, fenotipo sugerente de una inhibición de la replicación por acúmulo de mutaciones no reparadas. / Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) is considered a multifunctional protein with defined functions in numerous mammalian cellular processes. GAPDH functional diversity depends on various factors such as covalent modifications, subcellular localization, oligomeric state or intracellular concentration of substrates or ligands, as well as protein–protein interactions. In bacteria, alternative GAPDH functions have been associated with its extracellular location in pathogens or probiotics. In this study, new intracellular functions of Escherichia coli GAPDH were investigated following a proteomic approach aimed at identifying interacting partners using in vivo formaldehyde cross-linking followed by mass spectrometry. The identified proteins were involved in metabolic processes, protein synthesis and folding or DNA repair suggesting involvement of GAPDH in many cellular processes. Some interacting proteins were also identified in immunopurification experiments in the absence of cross-linking. Among the proteins identified as potential GAPDH interacting partners, we found the interaction with PGPase to be of special interest due to its physiological role in processes linked to DNA repair. This enzyme is involved in the metabolism of 2-phosphoglycolate formed in the DNA repair of 3’-phosphoglycolate ends generated by bleomycin damage. We show that PGPase-GAPDH interacting complexes increased in cells challenged with bleomycin, suggesting involvement of GAPDH in cellular processes linked to DNA repair mechanisms. The functional implication of GAPDH in DNA repair was evidenced in GAPDH deficient strains (gapA knockout mutants or conditional silencing of gapA gene by antisense RNA) following different approaches: (i) GAPDH deficient cells presented lower viability with respect to wild type cells when treated with bleomycin or the alkylating agent methyl methanesulfonate (MMS); (ii) The gapA mutant showed increased number of spontaneous apurinic / apyrimidinic (AP) sites in its DNA genomic; (iii) Pull-down experiments followed by Western Blot showed interaction of GAPDH with endonuclease IV (Endo IV), a protein involved in the repair of AP sites and with the single-stranded DNA binding protein (SSB), essential for DNA repair induced under conditions of SOS response. Finally, (iv) GAPDH deficient cells presented a filamentous morphology in stationary phase, phenotype that suggests an inhibition of cellular division, probably due to accumulation of unrepaired mutations as a consequence of GAPDH deficiency.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UB/oai:www.tdx.cat:10803/96984 |
| Date | 15 November 2012 |
| Creators | Ferreira Melo, Elaine |
| Contributors | Baldomà Llavinés, Laura, Giménez Claudio, Rosa, Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia) |
| Publisher | Universitat de Barcelona |
| Source Sets | Universitat de Barcelona |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 212 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
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