La bacteriorodopsina (BR) es una proteína transportadora de protones que se encuentra en la membrana de la arqueobacteria H. salinarum. Consta de siete hélices α y un cromóforo, el retinal, unido covalentemente a la hélice G. Ha sido muy estudiada debido a su similitud con la rodopsina visual y otras proteínas de la familia de las GPCRs, además de formar parte de uno de los sistemas fotosintéticos más sencillos que se conocen. La BR se activa mediante la absorción de un fotón por parte del retinal, lo que proporciona la energía necesaria para realizar el fotociclo. El resultado final es el transporte neto de un protón desde el lado citoplasmático al lado extracelular. A pesar de que su estructura y función son bien conocidas, todavía hay aspectos funcionales que no han sido suficientemente caracterizados. En este sentido, la existencia de un posible movimiento de las hélices E, F y G en el lado citoplasmático durante el proceso de reprotonación ha sido ampliamente debatida. El hecho de que estos movimientos hayan sido detectados solamente en estructuras cristalográficas de mutantes ha llevado a pensar que podría tratarse de un artefacto. Asimismo, los trabajos de Resonancia Paramagnética Electrónica (EPR) en proteína marcada con una sonda de spin han dado valores muy diversos para la magnitud de estos movimientos, creando también dudas sobre su existencia y su implicación en la función. Este trabajo ha tenido como objetivo estudiar la influencia de la flexibilidad de las hélices E-F y F-G en la función de la BR. Para ello se ha expresado una quimera de la BR, denominada Loop5, donde se ha ampliado la longitud, y por tanto la flexibilidad, del bucle E-F mediante la sustitución del bucle nativo por su homólogo en la rodopsina. Por otro lado se ha restringido la flexibilidad de las hélices E-F y F-G mediante la expresión de dos dobles mutantes cisteína y la formación de un puente disulfuro interhélice: F153C(E)/R175C(F) y E166C(F)/A228C(G). Tanto el aumento de la flexibilidad del bucle E-F como la restricción de la movilidad de estas hélices y de las hélices F-G provocan una profunda alteración en la función de transporte. Asimismo el estudio de estos mutantes sitúa este cambio entre los intermediarios M y N y demuestra que es imprescindible para que pueda darse el cambio de accesibilidad desde el lado extracelular al lado citoplasmático, mecanismo que asegura que el transporte sea unidireccional. El aumento de flexibilidad del bucle E-F tiene como consecuencia el aceleramiento del intermediario M. El intermediario N aparece más temprano y tiene un mayor tiempo de vida media. Durante este intermediario sería cuando la proteína tiene una apertura hacia el lado citoplasmático. Al restringir la flexibilidad de las hélices E-F en el mutante F153C/R175C los cambios en el fotociclo no parecen tan relevantes, sin embargo el estudio del intermediario N mediante FTIR muestra cambios estructurales importantes respecto a la proteína nativa. La restricción de la flexibilidad de las hélices F-G en el mutante E166C/A228C provoca profundas alteraciones en el fotociclo favoreciendo la acumulación del intermediario M. Los intermediarios N y O (durante los cuales se reprotona la BR) no se forman y el fotociclo sigue otro camino alternativo para volver al estado basal. Además, el hecho de que el proceso de expulsión del protón (que tiene lugar en el lado extracelular) esté afectado indica la existencia de un mecanismo de cuerpo rígido durante el fotociclo. Por tanto, la flexibilidad de las hélices E, F y G tiene un papel muy relevante en la función de la BR, sugiriendo que este mecanismo es importante en proteínas que constan de 7 hélices transmembrana (7TM). La estrategia de formar un puente disulfuro interhélice en la BR, mediante la introducción de dos cisteínas por mutagénesis dirigida, ha demostrado ser un buen método de estudio para determinar la relevancia de la flexibilidad de las hélices en la función de la proteína. Este método podría extrapolarse a otras proteínas 7TM. / Bacteriorhodopsin (BR) is a proton pump protein found in the membrane of the archaebacterium H. salinarum. It comprises seven α helices and a retinal chromophore covalently bound to the helix G. It has been widely studied because of its similarity to visual rhodopsin and other GPCR proteins as well as being part of one of the simplest photosynthetic systems known. BR is activated by absorption of a photon by the retinal, which provides the energy needed to perform the photocycle. As a result there is a net transport of a proton from the cytoplasmic to the extracellular side. Although its structure and function are well known, there are still functional aspects that have not been sufficiently characterized. In this sense, the existence of some movements on the cytoplasmic side of helices E, F and G during the reprotonation pathway has been widely debated. The fact that these movements have been detected only in crystallographic structures of mutants has questioned their existence in the native protein. Likewise, Electronic Paramagnetic Resonance studies (EPR) in spin labeled protein have shown different values for the magnitude of these movements, creating doubts about their relevance in protein function. This work has been aimed at studying the influence of the flexibility of helices E-F and F-G in the function of BR. For this propose, a BR chimera has been expressed replacing the native E-F loop by its homologous in rhodopsin. This chimera, called Loop5, has an extended length and flexibility of the E-F loop. On the other hand the flexibility of the E-F and F-G helices has been restricted by the expression of two double-cysteine mutants and the formation of an interhelix disulfide bond: F153C (E)/ R175C (F) and E166C (F)/ A228C (G). Both the increased flexibility of the E-F loop as the restriction of mobility of E-F and F-G helices causes a deep alteration in the proton pumping activity. The study of these mutants has also shown that helix movements happen between M and N intermediates and prove to be essential to enable the change of accessibility from the extracellular to the cytoplasmic side. This mechanism ensures that the transport is unidirectional. The increased flexibility of the E-F loop in Loop5 mutant leads to M intermediate acceleration. The N intermediate appears earlier and has a longer half-life. During this intermediate the protein has already changed its accessibility form the extracellular to the cytoplasmic side. By restricting the flexibility of helices E-F in F153C/R175C mutant the photocycle has not been significantly altered. However, the study of the N intermediate by means of FTIR has showed significant structural changes compared to the native protein. Restricting the flexibility of the F-G helices in E166C/A228C mutant causes a deep alteration in the photocycle favouring M intermediate accumulation. The N and O intermediates (BR reprotonation) do not form and the photocycle follows an alternative pathway to return to the ground state. Moreover, the fact that the process of proton release (which takes place on the extracellular side) is concerned points to the presence of a rigid-body mechanism during BR photocycle. Therefore, the flexibility of the helix E, F and G has a major role in the function of BR, suggesting that this mechanism is important in 7 transmembrane helices proteins (7TM). The strategy of cross-linking two helices by means of an engineered disulphide bond in BR has proved to be a good method to determine the relevance of the flexibility of some helices in protein function. This method could be extrapolated to other 7TM protein family.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UAB/oai:www.tdx.cat:10803/3612 |
| Date | 24 February 2009 |
| Creators | Simón Vázquez, Rosana |
| Contributors | Padrós, Esteve, Perálvarez Marín, Alejandro, Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular |
| Publisher | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Source Sets | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
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