Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRBB) / Nedd4L is a HECT-type E3 ubiquitin ligase (it covalently binds ubiquitin molecules before transferring them to the final substrate). Ubiquitination is a posttranslational modification (PTM) that labels proteins for a variety of fates, the most relevant one being proteasome-mediated degradation. Nedd4L is responsible for the regulation of the turnover of the sodium channel ß-ENaC as well as Smad2/3, mediator proteins of the signalling pathway activated by TGF-ß-like cytokines. It also targets the TGF-ß receptor itself. Defects in its function have been related to hereditary hypertension (Liddle’s syndrome), and could be relevant in certain sorts of cancer and metastasis.
CDK8/9 and GSK3-ß are two kinases that regulate the phosphorylation of the Smads, enabling them to carry out their function in cooperation with transcription factors and other partner proteins. At the same time, they label the Smads for their recognition by ubiquitin ligases. This provides the cell with a mechanism to give a transient response to the cytokines of the TGF-ß type. In order to identify the residues and the phosphorylation patterns that are relevant for the interactions of the Smads with both the transcription factors and the ubiquitin ligases, we have prepared a set of phosphopeptides corresponding to the sequences of Smad1 and Smad3.
Like all other members of the Nedd4 family, Nedd4L has a multi-domain architecture of the type C2-WW-HECT. Several ligases of the family exist in a latent conformation established through inter-domain contacts that occlude the catalytic site in the HECT domain, involving either the C2 domain (Smurf1, Smurf2, WWP2, Nedd4, Nedd4L) or the central segment where the WW domains are located (Itch). Certain cellular events displace these contacts, inducing the transition to the active conformation. In the case of Nedd4L, increases of the intracellular levels of Ca2+ activate the ligase. The hydrolysis of the membrane phospholipid phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) delivers into the cytosol the inositol 1,4,5-triphosphate (IP3), a second messenger that mobilizes the intracellular Ca2+ reserves. The C2 domain of Nedd4L interacts both with Ca2+ ions and with IP3. Using a structural and biophysical approach based on Nuclear Magnetic Resonance (NMR) we have described the specific interactions between the HECT and C2 domains that inhibit the catalytic function. Ca2+ binds the C2 domain with high affinity using the same binding surface and compromises these contacts. In addition, it mediates the interaction with IP3. These results provide the structural fundament for the activation and the relocation to the plasma membrane of Nedd4L mediated by Ca2+.
The HECT domain has a highly conserved PY site (HECT-PY). The PY motifs are the sequences recognized by WW domains. Central to this recognition is the coordination of the tyrosine residue in the PY motif by the WW domain. In the crystallographic structure of the Nedd4L HECT domain the tyrosine residue of the HECT-PY motif appears buried in the hydrophobic core and not accessible for binding. It has been shown that the WW domains of Nedd4L recognize the HECT-PY motif of the ligase only after the unfolding of the HECT domain. We raised the hypothesis that the recognition of the HECT-PY motif by one of Nedd4L WW domains may play a role in the auto-ubiquitination mechanism of the ligase. Our data confirm that only when the fold of the HECT domain is partially damaged, the PY site is accessible for being recognized by the WW domains. We present the NMR solution structure of the complex between the WW3 domain and the HECT-PY motif. The site is protected in functional Nedd4L molecules, which are able to recognize it in damaged molecules and label them with ubiquitin for degradation. / Nedd4L és una E3 ubiquitín lligasa responsable de la regulació de la vida mitja del canal de sodi ß-ENaC i de Smad2/3, proteïnes mediadores de la ruta de senyalització activada per citocines TGF-ß. Defectes en la seva funció han estat relacionats amb la hipertensió hereditària (Síndrome de Liddle), i podrien ser rellevants en determinats tipus de càncer i metàstasi.
CDK8/9 i GSK3-ß són dues quinases que regulen l’estat de fosforilació de les Smads, habilitant-les per dur a terme llur funció en cooperació amb factors de transcripció al mateix temps que les marquen per ser reconegudes per ubiquitín lligases. Amb l’objectiu d’identificar els residus i els patrons de fosforilació rellevants hem preparat un set de fosfopèptids que corresponen a les seqüències de Smad1/3.
Nedd4L presenta una arquitectura multi-domini C2-WW-HECT. Diverses lligases de la família de Nedd4 existeixen en una conformació latent en què contactes inter-domini oclouen el lloc catalític en el domini HECT, involucrant bé el domini C2 (Smurf1/2, WWP2, Nedd4, Nedd4L) o la zona central amb els dominis WW (Itch). Certs esdeveniments cel•lulars desplacen aquests contactes, induint la transició a la conformació activa. L’increment dels nivells intracel•lulars de Ca2+ activa Nedd4L. La hidròlisi del fosfolípid de membrana PIP2 allibera l’IP3 provocant aquest increment. El domini C2 de Nedd4L interacciona tant amb el Ca2+ com amb l’IP3. Utilitzant l’RMN hem descrit els contactes HECT-C2 en la conformació latent i hem observat que el Ca2+ s’uneix al domini C2 amb alta afinitat utilitzant el mateix lloc d’unió, a més d’afavorir la interacció amb l’IP3. Així, hem aportat el fonament estructural per a l’activació i relocalització a la membrana cel•lular de Nedd4L.
El domini HECT presenta un lloc PY altament conservat (HECT-PY). Els motius PY són reconeguts pels dominis WW. Proposem que el reconeixement del motiu HECT-PY per part d’un dels dominis WW de Nedd4L estigui implicat en l’auto-ubiquitinació. Hem observat que només quan el plegament del domini HECT està compromès, el lloc PY és accessible. Presentem l’estructura per RMN del complex WW3-HECT-PY. El motiu està protegit en molècules funcionals de Nedd4L, capaces de reconèixer-lo en molècules danyades i ubiquitinar-les.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UB/oai:www.tdx.cat:10803/284605 |
| Date | 06 November 2014 |
| Creators | Escobedo Pascual, Albert |
| Contributors | Macías Hernández, María J., Universitat de Barcelona. Facultat de Farmàcia |
| Publisher | Universitat de Barcelona |
| Source Sets | Universitat de Barcelona |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 250 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
Page generated in 0.0023 seconds