Les Brain Specific Kinase 1 i 2 (BRSK1 i 2), també conegudes com a SAD quinases, són
proteïnes Ser/Thr quinases de la família de les AMPK-related kinases. Les BRSKs són activades
per fosforilació directa de la quinasa màster LKB1 en un residu conservat del loop d’activació o
T-loop (Thr189 per BRSK1 i Thr174 per BRSK2). Les BRSKs presenten un domini quinasa a
l’extrem N-terminal seguit d’un domini d’unió a ubiquitines (UBA) i una cua a l’extrem Cterminal
sense dominis funcionals identificables. Aquestes quinases s’expressen
majoritàriament al sistema nerviós, on regulen la polarització neuronal, la sinaptogènesis i
l’alliberament de neurotransmissors. Malgrat això, els mecanismes implicats en la regulació
d’aquestes quinases no han estat descrits.
En aquest treball, mitjançant fraccionament subcel·lular i tinció immunocitoquímica,
demostrem en diferents tipus cel·lulars que una fracció de BRSK1 localitza en membranes i que
és resistent a l’extracció pel detergent Triton X-100. A més, utilitzant sinaptosomes de cervell
de rata, demostrem la presència de BRSK1, però no de BRSK2, en microdominis de membrana
lipid raft. Amb l’objectiu de determinar el mecanisme d’associació a la membrana, s’ha
observat en extractes de cervell de rata que BRSK1, a diferència de BRSK2, està palmitoilada.
La palmitoilació és una modificació post-traduccional en la que un residu de cisteïna es
modifica covalentment per palmitat. Malgrat que s’han generat diferents els mutants
individuals i combinacions de tots els residus de cisteïna, no s’ha identificat el/s residu/s
modificats per palmitoilació.
Estudis previs d’activitat quinasa realitzats al laboratori mostren que la incubació de
BRSK1 amb vesícules generades amb els lípids dels lipid rafts resulta en un augment de
l’activitat quinasa, el que suggereix que BRSK1 podria interaccionar amb algun dels lípids
presents a lipid rafts. Mitjançant assajos de lipid-protein overlay assay i d’unió a liposomes,
hem observat que BRSK1 uneix específicament la sulfogalactosilceramida sulfàtid. A més,
liposomes que contenen sulfàtid activen a la BRSK1 in vitro, el que representa un nou
mecanisme d’activació de BRSK1, possiblement al·lostèric. La generació de mutants de deleció
de BRSK1 que codifiquen per diferents dominis i regions, ha permès la identificació de la regió
de la cua C-terminal anomenada short conserved region 2 (SCR2, responsable de la localització
puntuada de BRSK1 en neurones), com la principal regió d’unió al sulfàtid.
D’altra banda, hem observat que BRSK1 està ubiquitinada in vivo en assajos en cèl·lules
tractades amb l’inhibidor del proteosoma MG-132. Després de considerar diferents E3
ubiquitina lligases implicades en la polarització neuronal (Trim2 i Smurf1/2), hem determinat
en cèl·lules en cultiu que Smurf1 interacciona amb BRSK1 i la ubiquitina. Aquesta observació
ha estat corroborada mitjançant estudis d’ubiquitinació in vitro amb les proteïnes purificades,
on també s’ha comprovat que la poliubiquitinació de BRSK1 per Smurf1 no genera
ramificacions d’ubiquitina a través de les Lys 48 i 63. D’altra banda, la ubiquitinació de BRSK1
per Smurf1 és de tipus degradatiu, ja que la sobreexpressió de la lligasa salvatge, però no la
inactiva, resulta en una disminució dels nivells de la BRSK1 cel·lular.
Smurf1 indueix la degradació específica de proteïnes implicades el establiment de la
polaritat neuronal. En neurones no diferenciades Smurf1 ubiquitina i promou la degradació de
proteïnes pro-polaritzants, com Par6. En resposta a augments de AMPc, la proteïna kinasa A
(PKA) fosforila Smurf1 a la Thr306, promovent la degradació de proteïnes que inhibeixen el
creixement axonal a la neurita que esdevindrà axó. En aquest treball demostrem que la forma
no fosforilada d’Smurf1 ubiquitina BRSK1 i en promou la seva degradació, mentre que la
fosforilació d’Smurf1 per PKA impedeix aquesta degradació. Ja que hem descrit un augment en
els nivells de BRSK1 als primers estadis de la diferenciació neuronal, els nostres resultats
suggereixen un mecanisme de regulació de la expressió BRSK1 controlat per Smurf1 durant
l’establiment de l’eix axó-dendrita, com el descrit per Par6. / Brain Specific Kinases 1 and 2 (BRSK1 and 2, also known as SAD kinases) are members
of the family of AMPK-related Ser/Thr protein kinases. BRSKs are activated by the master
kinase LKB1, thorough the phosphorylation of a threonine residue (T189 for BRSK1, T174 for
BRSK2) within the activation loop of the kinase domain. BRSKs have a kinase domain located at
the N-terminal, followed by an ubiquitin-binding domain (UBA) and a C-terminal tail with no
identifiable functional domains. The BRSKs are mainly expressed at the nervous system, where
regulate neuronal polarization, synaptogenesis and neurotransmitter release. However, the
mechanisms remain to be described.
Here, using subcellular fractionation and immunocytochemical staining of different
cultured cells, we show a pool of cellular BRSK1 that localizes at the membrane, which is
resistant to Triton X-100 solubilization. We also show that BRSK1, but not BRSK2, a) associates
to lipid rafts microdomains; and b) is palmitoylated. Palmitoylation is the post-translational
modification in which the palmitic acid is covalently attached to a cysteine residue. In spite of
generating different BRSK1 mutants in which single or several cysteines were mutated, we
have not been able to identify primary Cys residue/s palmitoylated.
Previous studies carried out in our laboratory showed that liposomes generated with
lipids extracted from raft fractions enhance BRSK1 kinase activity, suggesting that BRSK1 could
interact with any of the lipids present in lipid rafts. Using lipid-protein overlay and liposomebinding
assays, we show that BRSK specifically interacts with the galactosylceramide sulfatide.
Furthermore, sulfatide-containing liposomes specifically enhance BRSK1 activity in vitro,
underpinning that interaction with sulfatide represents a new, allosteric mechanism of BRSK1
activity modulation, additional to T-loop phosphorylation. Generation of BRSK1 deletion
mutants of different regions and domains allowed the identification of the short conserved
region 2 (SCR2, located at the C-tem tail and responsible for the punctuate pattern of neuronal
BRSK1) as the main region involved in the binding of sulfatide to BRSK1.
We found that BRSK1 is ubiquitylated in cells treated with the proteasome inhibitor
MG-132. After studying the E3 ubiquitin ligases which regulate neuronal polarization (Trim2
and Smurf1/2), we show in cultured cells that Smurf1 interacts with and ubiquitylates BRSK1.
This observation was confirmed by in vitro ubiquitylation assays, using purified proteins, and
allowed to determine that Smurf1-mediated ubiquitylation of BRSK1 does not results in Lys-48
or Lys-63 polyubiquitin branches. On the other hand, Smurf1-mediated BRSK1 ubiquitylation
leads to BRSK1 degradation, since over-expression of wild type Smurf, but not of the inactive
protein, results in a drastic reduction of cellular BRSK1 expression levels.
Smurf1 induces specific degradation of proteins which control neuronal polarization. In
undifferentiated neurons, Smurf1 ubiquitylates and promotes degradation of pro-polarization
proteins, such Par6. In response to an increase on cAMP, protein kinase A (PKA)
phosphorylates Smurf1 at Thr306, inducing the degradation of the proteins that inhibit axonal
growth in the neurite that will become an axon. Here we show that a non-phosphorylatable
form of Smurf1 ubiquitylates and promotes BRSK1 degradation, while PKA-mediated Smurf1
phosphorylation prevents BRSK1 degradation. Since we have shown increasing BRSK1
expression levels during the early stages of neuronal differentiation, our results suggest that
Smurf1 might control BRSK1 expression during neuronal polarization, as it does for Par6.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UAB/oai:www.tdx.cat:10803/129384 |
| Date | 17 December 2013 |
| Creators | Ruiz Babot, Gerard |
| Contributors | Lizcano de Vega, José Miguel, Gómez Trias, Néstor, Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular |
| Publisher | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Source Sets | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Language | Catalan |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 239 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
Page generated in 0.0141 seconds