La vía de señalización celular MEK5-ERK5 se activa en respuesta a un amplio rango de
factores de crecimiento y diferentes tipos de estrés. Fosforila los factores de transcripción
de la familia MEF2 y juega un relevante papel en el control de la proliferación celular
inducida por factores como el EGF, además de controlar la supervivencia celular y la
angiogénesis. ERK5 difiere estructuralmente de otras MAP quinasas en presentar una
larga y única cola C-terminal. Esta cola tiene un efecto autoinhibitorio sobre la actividad
quinasa y presenta un motivo de localización nuclear NLS (sólo accesible en la
conformación activa/abierta de la quinasa), además de un dominio de activación
transcripcional que interacciona con MEF2D y potencia la actividad transactivadora del
factor de transcripción AP-1. Así, ERK5 activa la transcripción de ciertos genes no sólo por
la fosforilación directa de factores de transcripción, sino también actuando como coactivador
transcripcional de, por ejemplo, el factor AP-1.
Previamente en nuestro laboratorio, utilizando la técnica del Tandem Affinity Purification
(TAP), se identificó a la chaperona Hsp90β como una putativa proteína que interacciona
con ERK5. En este trabajo, mediante ensayos de co-inmunoprecipitación de las proteínas
endógenas y sobre-expresadas, demostramos que ERK5 forma un complejo trimérico con
las chaperonas Hsp90β y Cdc37, y que la inhibición farmacológica de Hsp90β o Cdc37
induce la ubiquitinación y degradación proteosomal de ERK5. Estos resultados proponen
a ERK5 como una nueva proteína cliente de la chaperonas Hsp90/Cdc37, necesarias para
el correcto plegamiento y mantenimiento de la estructura de la quinasa.
Por primera vez se muestra que la activación canónica de ERK5 (por MEK5) induce la
disociación de Hsp90 del complejo ERK5-Cdc37, como paso previo a la translocación
nuclear de ERK5 y la consiguiente activación de la transcripción, por un mecanismo que
requiere la autofosforilación de la cola C-terminal de la quinasa. Por otra parte, se ha
establecido que la expresión de Cdc37 en exceso (como ocurre en algunos tipos de
cáncer) promueve la disociación de Hsp90 del complejo y la translocación nuclear de una
forma inactiva de ERK5 capaz de potenciar la actividad transcripcional del factor AP-1.
Este resultado constituye la primera evidencia de un mecanismo no canónico de
translocación que implica la entrada en el núcleo de una ERK5 inactiva que retiene la
capacidad de activar la transcripción mediada por el factor AP-1. También se propone a
Hsp90 como una proteína que serviría de anclaje citosólico de ERK5. Por otra parte, se
han obtenido evidencias que muestran que tanto la activación canónica (MEK5) como no
canónica (Cdc37) inducen la SUMOilación de ERK5 en el extremo N-terminal de la
proteína. Mediante ensayos bioquímicos y de inmunofluorescencia aportamos evidencias
que apuntan a que tanto la disociación de Hsp90 como la SUMOliación son eventos
necesarios pero no suficientes per se para que ocurra la translocación nuclear de ERK5.
Se han generado líneas celulares que sobre-expresan establemente ERK5 y/o Cdc37, que
muestran que ambas proteínas cooperan en promover un drástico incremento en la
proliferación y la migración celular. Este resultado es relevante dado que la sobreexpresión
de ERK5 como Cdc37 son eventos que ocurren en ciertos tipos de cáncer,
como el adenocarcinoma prostático. Por último, mostramos que ERK5 interacciona con el
receptor de andrógenos (AR) en el citosol de las células en reposo, y que la activación de
este receptor con ligandos induce la translocación de AR y ERK5 inactiva al núcleo, donde
siguen interaccionando y colaboran en la promoción de la actividad transcripcional del AR
sobre la proteína antígeno prostático (PSA, biomarcador clínico especifico del cáncer de
próstata). Se ha observado otro link funcional entre ambas proteínas, ya que la activación
de ERK5 por MEK5 o la sobre-expresión de Cdc37 incrementan la actividad ligandodependiente
del receptor de andrógenos, mientras que el silenciamiento de la ERK5
celular bloquea dicha activación transcripcional. / The MEK5-ERK5 signaling pathway is activated in response to growth factors and different
forms of stress. ERK5 phosphorylates the transcription factors, members of the myocyte
enhancer factor family, MEF2 and plays an important role in the control of cell proliferation
induced by factors such as EGF, as well as control of cell survival and angiogenesis. In
contrast with other MAPKs, ERK5 has a unique C-terminal tail. This domain auto-inhibits
the kinase activity and has a nuclear localization signal (NLS) (only available in the
active/open conformation), moreover contains a transcriptional activation domain that
interacts with MEF2D and enhances the activity of the AP-1 transcriptional complex. Thus,
ERK5 is able to activate transcription not only by direct phosphorylation of transcription
factors but by acting itself as a transcriptional coactivator, as, for example, in the case for
the activator protein 1 (AP-1) transcription factor.
Previously in our laboratory using the technique of Tandem Affinity Purification (TAP), we
identified the chaperone Hsp90β as a putative interacting protein ERK5. In this study,
using co-immunoprecipitation assays of endogenous and recombinant proteins, we
demonstrated that ERK5 forms a trimeric complex with Hsp90β and Cdc37, and the
pharmacological inhibition of Hsp90 and Cdc37 induces ubiquitination of ERK5 prior to
degradation at the proteasome. These results suggest that ERK5 is a novel client protein
of the chaperone Hsp90/Cdc37, and these chaperones are necessary to maintain the
proper folding and structure of the kinase.
For the first time we show that the canonical activation of ERK5 (by MEK5) induces the
Hsp90 dissociation from the ERK5-Cdc37 complex, leading to ERK5 nuclear translocation
and activation of transcription, by a mechanism which requires the autophosphorylation at
its C-terminal tail. Moreover, the overexpression of Cdc37 (as in some types of cancer)
promotes Hsp90 dissociation and the nuclear translocation of a kinase-inactive form of
ERK5 which retains transcriptional activity. This is the first example showing that ERK5
transcriptional activity does not require kinase activity. We propose that Hsp90 might be
the cytosolic anchor of ERK5. Moreover, we show that both the canonical activation
canonical (MEK5) as noncanonical (Cdc37) induce the ERK5 SUMOylation at its Nterminal
half. The biochemical and immunofluorescence assays provided evidence that
both the Hsp90 dissociation as the ERK5 SUMOylation are necessary but not sufficient per
se to induce ERK5 nuclear translocation.
We generated stable cell lines that over-express ERK5 and/or Cdc37, we showed that both
proteins cooperate to promote a dramatic increase in cell proliferation and migration. This
result is important because overexpession of ERK5 and Cdc37 are events that occur in
certain types of cancer, including prostate adenocarcinoma. Finally, we show that ERK5
interacts with the androgen receptor (AR) in the cytosol of resting cells, and that activation
of this receptor with ligands induces the nuclear translocation of AR and inactive ERK5,
and in this cellular compartment they continue interacting and promoting the transcriptional
activity of AR through PSA (PSA specific clinical biomarker for prostate cancer). It has
been observed another functional link between these proteins, and that activation of ERK5
by MEK5 or overexpression of Cdc37 increase ligand-dependent activity of the androgen
receptor, whereas the silencing of ERK5 inhibits this transcriptional activation.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UAB/oai:www.tdx.cat:10803/131290 |
| Date | 18 July 2013 |
| Creators | Erazo Andrade, Ingrid Tatiana |
| Contributors | Gómez Trias, Néstor, Lizcano de Vega, José Miguel, Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular |
| Publisher | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Source Sets | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 215 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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