Els test de resistència al antiretrovirals són utilitzats en la pràctica clínica per la
personalització del tractament antiretroviral (TARV) de les persones infectades pel
VIH-1. La seqüenciació poblacional (SP) és la tècnica més emprada pel genotipat del
VIH-1 obtenint una bona correlació amb la resposta clínica dels pacients. No obstant,
la baixa sensibilitat de la SP pel que fa a la detecció de mutacions de resistència als
antiretrovirals (DRM) o soques X4-tròpiques presents en baixes prevalences pot
comprometre l’eficàcia del TARV. L’aplicació de noves tècniques de seqüenciació
massiva pel genotipat del VIH-1 (genotipat ultrasensible) permetria una caracterització
de la població viral amb major resolució optimitzant el TARV.
L’objectiu d’aquesta tesi era avaluar el valor clínic del genotipat ultrasensible pel
maneig clínic de pacients infectats pel VIH-1 que han estat exposats a TARV.
Durant la utilització de 454 sequencing per la determinació del tropisme viral, 454
sequencing va obtenir una major concordança amb ESTA (Enhanced Sensitivity
TrofileTM Assay) en l’anàlisi de l’ARN viral. Tot i que la SP tenia una menor sensibilitat
respecte 454 sequencing, la seva elevada especificitat li va permetre obtenir una millor
precisió. Anàlisis filogenètics a partir de dades obtingudes per 454 sequencing van
revelar que, encara que les determinacions eren equivalents entre amdós
compartiments, en alguns pacients es va observar compartimentalització de
seqüències pel que fa als haplotips i a la seva prevalença. Aquesta
compartimentalització podria comprometre la determinació del tropisme viral en funció
del compartiment que s’analitzi.
Durant aquest treball també es va fer la validació de la SP per determinacions del
tropisme a partir d’ADN proviral en un assaig clínic prospectiu i aleatoritzat. Aquest
assaig va demostrar ser útil per guiar canvis de tractament antiretroviral que incloguin
antagonistes de CCR5. De tota manera, 454 sequencing va ser capaç de detectar
variants X4 tròpiques en dos pacients prèviament classificats com a R5 tròpics per SP.
Pel que fa a la detecció de DRM en el gen pol, 454 sequencing va demostrar ser
no-inferior a la SP durant l’avaluació de la susceptibilitat al tractament antiretroviral.
Cal destacar que 454 sequencing va aportar informació genotípica addicional en la
majoria dels pacients, encara que aquesta modifiqués poques prediccions de
susceptibilitat. A més, aquesta tecnologia va ser utilitzada per explorar l’origen de les
DRM en el gen de la integrasa del VIH-1, demostrant que virus mutants detectats durant el fracàs virològic poden ésser originats a partir de virus mutants minoritaris preexistents.
En resum, aquesta tesi ha mostrat la utilitat clínica del genotipat ultrasensible del
VIH-1 en pacients experimentats al TARV. 454 sequencing ha permès una profunda
caracterització de la diversitat viral dins l’hoste, facilitant l’estudi l’evolució viral i la seva
patogènesi del VIH-1. A més, l’estandarització i automatització dels protocols de 454
sequencing permetria la implementació d’aquesta tecnologia pel diagnòstic del VIH-1. / Los ensayos de resistencia a los antiretrovirales son utilizados en la práctica
clínica para la personalización del tratamiento antirretroviral (TARV) de las personas
infectadas por el VIH-1. La secuenciación poblacional (SP) es la técnica más utilizada
para el genotipado del VIH-1 obteniendo una buena correlación con la respuesta
clínica de los pacientes. Asimismo, la baja sensibilidad de la SP para la detección de
mutaciones de resistencia a los antiretrovirales o variantes X4-trópicas presentes en
baja prevalencia puede comprometer la eficacia de la TARV.
El objetivo de esta tesis era evaluar el valor clínico del genotipado ultrasensible
para el manejo clínico de pacientes infectados por el VIH-1 que han estado expuestos
a TARV.
Durante la utilización de 454 sequencing para la determinación del tropismo viral,
454 sequencing obtuvo una mayor concordancia con ESTA (Enhanced Sensitivity
TrofileTM Assay) en el análisis del ARN viral. Aunque la SP mostró una menor
sensibilidad que 454 sequencing, su elevada especificidad le permitió obtener una
mayor precisión. La información genotípica generada por 454 sequencing fue utilizada
para evaluar la compartimentalización. Aunque las determinaciones del tropismo viral
eran equivalentes entre los compartimentos, en algunos pacientes se observó
compartimentalización de secuencias, lo que puede comprometer la determinación del
tropismo viral en función del compartimento que analizado.
Durante este trabajo también se hizo la validación de la SP para determinaciones
del tropismo a partir de ADN proviral en un ensayo clínico prospectivo y aleatorizado.
Este ensayo demostró ser útil para guiar cambios de tratamiento antirretroviral que
incluyan antagonistas de CCR5. De todos modos, 454 sequencing fue capaz de
detectar variantes X4 trópicas en dos pacientes previamente clasificados como R5
trópicos por SP.
En cuanto a la detección de DRM en el gen pol, 454 sequencing demostró ser no
inferior a la SP durante la evaluación de la susceptibilidad al tratamiento antirretroviral.
Cabe mencionar que 454 sequencing aportó información genotípica adicional en la
mayoría de los pacientes, aunque esta modificara pocas predicciones de
susceptibilidad. Además, esta tecnología fue útil para explorar el origen de las DRM en
el gen de la integrasa del VIH-1, mostrando que los mutantes detectados durante el
fracaso virológico pueden ser originados a partir de mutantes pre-existentes. En resumen, esta tesis ha mostrado la utilidad clínica del genotipado ultrasensible
del VIH-1 en pacientes experimentados al TARV. 454 sequencing ha permitido una
profunda caracterización de la diversidad viral dentro del huésped, facilitando el
estudio de la evolución viral i la patogénesis del VIH-1. Además, la estandarización i
automatización de los protocolos de 454 sequencing permitiría la implementación de
esta tecnología para el diagnóstico clínico del VIH-1. / Drug resistance testing is utilized in the clinical routine to personalize ART of HIV-1
infected people. Population sequencing is employed for HIV-1 genotyping obtaining
good correlations with clinical outcomes. However, its lack of sensitivity to detect
minority DRM mutations or minor CXCR4-using viruses can compromise the efficacy of
antiretroviral therapy (ART). The use of next generation sequencing technologies for
ultrasensitive HIV-1 genotyping might allow deep characterization of the viral
population optimizing the ART.
The objective of this work was to evaluate the clinical value of ultrasensitive HIV-1
genotyping obtained by 454 sequencing for the management of ART-experienced HIV-
1 subjects in different treatment situations.
During the utilization of 454 sequencing for viral tropism determinations, this
technology achieved the closest diagnostic accuracy to ESTATM in plasma ARN.
Although population sequencing had lower sensitivity than 454 sequencing, its highest
specificity led to obtain closest accuracy to ESTA. Even though tropism determinations
were equivalent between plasma and cellular compartments, phylogenetic analyses
from data generated by 454 sequencing revealed sequence compartmentalization in
some subjects.
We also validated triplicate population HIV-1 genotyping from PBMC-associated DNA
for viral tropism determinations in a prospective and randomized clinical trial. Here,
genotypic tropism testing in proviral DNA demonstrated to become a suitable tool to
guide treatment switches to CCR5 antagonists in aviremic individuals. In this study,
454 sequencing was capable to detect non-R5 viral strains in two subjects previously
classified as harboring R5 HIV-1 strains by population sequencing. This
compartmentalization might compromise viral tropism determinations depending on the
compartment analyzed. Furthermore, the absence of evolution observed during
prolonged periods of aviremia suggested that testing of stored plasma sample would
be generally safe and informative.
Regarding the detection of minority DRM in pol gene, 454 sequencing for ultrasensitive
HIV-1 genotyping was technically non-inferior than population HIV-1 genotyping during
the assessment of antiretroviral drug susceptibility. However, although this technology
provided additional genotypic information beyond population sequencing in most of heavily pre-treated individuals tested, only few antiretroviral susceptibility predictions
were modified.
This technology was also useful to explore the origin of DRM in integrase gene,
revealing that mutants detected at the time of virological failure can be originated from
pre-existing minority drug resistance variants.
In summary, this thesis has shown the clinical utility of ultrasensitive HIV-1
genotyping in ART-experienced HIV-1 infected individuals. However, further studies
should extend our findings.
454 sequencing allowed a deep characterization of the HIV-1 diversity within a host
helping to understand viral evolution and HIV-1 pathogenesis. Moreover, the
standardization and automation of 454 sequencing protocols for HIV-1 sequencing
would allow the implementation of this technology for HIV-1 diagnosis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UAB/oai:www.tdx.cat:10803/129499 |
| Date | 06 November 2013 |
| Creators | Pou Gonzàlez, Christian |
| Contributors | Paredes i Deiros, Roger, Farrés i Vicén, Jaume, Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular |
| Publisher | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Source Sets | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Language | English |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 256 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs., info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 1.1241 seconds