Las ribonucleases humanas son un grupo heterogéneo de proteínas pertenecientes a la
superfamilia de la Ribonucleasa A. Estas proteínas se caracterizan por su capacidad de
hidrolizar ácidos ribonucleicos y por la presencia de actividad antimicrobiana frente
diversos organismos patógenos como bacterias, hongos, parásitos y virus.
El primer objetivo del presente estudio doctoral se centra en la caracterización de la
actividad antimicrobiana y en modelos de membrana de las formas nativas de la
ribonucleasa 3 purificadas a partir de eosinófilos. Las distintas formas nativas presentan
modificaciones postraduccionales dadas por diversos grados de glicosilación que se
correlacionan con la activación de los eosinófilos durante los procesos inflamatorios. El
estudio establece la capacidad antimicrobiana de las formas nativas y su actividad en
modelos de membrana. Los resultados indican que las modificaciones
postrasduccionales modulan la actividad biológica de la RNasa 3, sugiriendo una
contribución in vivo en su función fisiológica.
Como segundo objetivo de esta tesis, se evaluó por primera vez en nuestro grupo de
investigación la actividad antimicótica de las ribonucleasas 3 y 7 frente al hongo
Candida albicans, el cual fue elegido como modelo patógeno eucariota. Se determinó y
caracterizó la presencia de actividad frente a Candida por parte de ambas ribonucleasas
humanas.
Por último, el tercer objetivo de esta tesis se centra en la purificación y caracterización
de la ribonucleasa 8, la más reciente ribonucleasa humana descrita, identificada
inicialmente en placenta. La RNasa 8 presenta un patrón inusual de enlaces disulfuro
respecto a sus proteínas homólogas. Este cambio estructural modifica la estabilidad de
la proteína y expone regiones que facilitan el proceso de agregación proteica. Fue
necesaria la previa optimización de un protocolo alternativo de purificación. Se
analizaron sus propiedades antimicrobianas, sugiriendo su posible participación en la
respuesta inmunitaria innata.
Los resultados del presente estudio corroboran las propiedades antimicrobianas de
diversas ribonucleasas humanas miembros de la familia de la RNasa A, sugiriendo una
función ancestral en el sistema de defensa innato. El estudio contribuye a la
comprensión de su mecanismo de acción y plantea su potencial uso como herramientas
terapéuticas. / Human ribonucleases are a heterogeneous group of proteins belonging to the
superfamily of RNase A. These proteins are characterized by their ability to hydrolyse
ribonucleic acids and the presence of antimicrobial activity against various pathogens
including bacteria, fungi, parasites and viruses.
The first objective of this doctoral study is focused on the antimicrobial characterization
of native Ribonuclease 3 forms purified from eosinophils. Native forms present posttranslational
modifications giving different glycosylation grades that modulate their
activity during inflammatory processes. This study aims to establish the antimicrobial
properties of native forms purified from eosinophils and their activity in a membrane
model system. Results indicate that post-translational modifications contribute to the the
protein biological activities, suggesting a related physiological role.
As a second objective, we evaluated for the first time the antifungal activity of the
antimicrobial RNase 3 and RNase 7 against Candida albicans, an eukaryotic pathogen
selected as a simple model to test the antimicrobial mechanism of action. Both human
ribonucleases displayed a high antifungal activity. Results highlighted a dual
mechanism of action, where cell lysis takes place at high protein concentration, while
depolarization, cell internalization and cellular RNA degradation is achieved at
sublethal doses.
Finally, the last objective is focused on the characterization of ribonuclease 8, also
called the placental RNase, the most recent human ribonuclease described. RNase 8 has
gained and lost one cysteine residue in non-conserved positions in a mechanism called
"disulphide shuffling". The protein tendency to aggregate required the design of an
alternative purification protocol. We analysed its antimicrobial abilities, suggesting a
possible role in innate defence.
The results of this study confirmed the high antimicrobial activity of several human
ribonucleases from the RNase A superfamily suggesting an ancestral role in the host
immune defence response. The study contributed to the understanding of their
mechanism of action and set the basis for applied drug design.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UAB/oai:www.tdx.cat:10803/310611 |
| Date | 04 September 2015 |
| Creators | Salazar Montoya, Vivian Angélica |
| Contributors | Boix Borras, Ester, Moussaoui, Mohamed, Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular |
| Publisher | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Source Sets | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Language | English |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 314 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | L'accés als continguts d'aquesta tesi queda condicionat a l'acceptació de les condicions d'ús establertes per la següent llicència Creative Commons: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/es/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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