La activación del Receptor de Muerte Fas, también llamado APO-1 o CD95, da
lugar a la formación del Death Inducing Signaling Complex (DISC). Este
complejo proteico contiene FADD y caspasa-8, entre otras proteínas, y causa el
corte y activación de caspasa-8, que finalmente da lugar a la apoptosis. Existen
dos vías de señalización diferenciadas en la apoptosis inducida por Fas. En las
células tipo I, la activación de Fas da lugar a la formación de altos niveles de
DISC, y los niveles de caspasa-8 son suficientes para cortar directamente la
caspasa-3 ejecutora, que desencadena la apoptosis. En las células tipo II, los
niveles de formación de DISC son más bajos y caspasa-3 no es cortada
directamente por caspasa-8. En vez de ello, caspasa-8 corta la proteína BH3-
only Bid, dando lugar a su forma truncada tBid, que transloca a la mitocondria e
induce su permeabilización. Esto conlleva la salida de factores apoptogénicos
de la mitocondria al citosol, como citocromo c, que da lugar a la activación de
caspasa-3 a través del apoptosoma. Así, las células tipo II necesitan un paso
de amplificación de la señal a través de la mitocondria. Los Antagonistas de los
Receptores de Muerte son proteínas que son capaces de modular la actividad
de los Receptores de Muerte. Entre ellos, Lifeguard (LFG), también llamado
NMP35 o FAIM2, es un antagonista de Fas altamente expresado en el sistema
nervioso. Esta proteína ha sido caracterizada como un inhibidor de la apoptosis
inducida por Fas, y se ha comprobado su localización en los sitios postsinápticos
y en las dendritas. Además, se ha comprobado que interacciona
directamente con el receptor Fas en los rafts, e inhibe la actividad de las
caspasas-8 y -3 tras la activación de Fas. Sin embargo, su mecanismo de
acción aún no ha sido descrito. En este trabajo tratamos de arrojar algo de luz
sobre este problema. Primero, resultados previos en nuestro laboratorio
mostraron que LFG interacciona con varias proteínas del sistema ubiquitina.
Confirmamos que LFG está ubiquitinado, y también mostramos que esta
ubiquitinización no induce su degradación. Además, nuestros resultados
sugieren que la ubiquitinización de LFG es no-canónica. Por otro lado, llevamos
a cabo un extenso estudio para elucidar la localización subcelular de LFG.
Demostramos que LFG localiza en las membranas del RE y del Golgi, y en
menor medida, también en los endosomas. Dado que LFG es miembro de la familia de proteínas TMBIM, que son capaces de modular la actividad de las
proteínas de la familia Bcl-2, investigamos su relación con ellas, y encontramos
que interacciona con Bcl-xL y Bcl-2 a través de su región C-terminal. Además,
demostramos que LFG solamente protege a las células tipo II de la muerte
inducida por Fas, y esta protección es dependiente de la expresión endógena
de Bcl-xL. Para finalizar, nuestros resultados revelan un paso no descrito hasta
el momento en la vía de señalización de las células tipo II. La movilización de
calcio del RE se ha comprobado que es relevante en la vía de señalización
apoptótica inducida por Fas. Aquí, demostramos que LFG modula la salida de
calcio del RE tras la estimulación de Fas, e inhibe la apoptosis inducida por Fas
en células tipo II. Basándonos en estas observaciones, proponemos que LFG
protege de la apoptosis inducida por Fas mediante la modulación de la salida
de calcio del RE. / Activation of the Death Receptor Fas, also called APO-1 or CD95, leads to the
formation of the Death Inducing Signaling Complex (DISC). This protein
complex comprises FADD and caspase-8, among other proteins, and it causes
the cleavage and activation of caspase-8, that ultimately leads to apoptosis.
There are two differentiated pathways in the Fas induced apoptosis. In type I
cells, high levels of DISC are formed upon Fas activation, and caspase-8 levels
are sufficient to directly cleave the effector caspase-3, which will trigger
apoptosis. In type II cells, DISC formation levels are lower and caspase-3 is not
directly cleaved by caspase-8. Instead, caspase-8 cleaves the BH3-only protein
Bid, generating its truncated form tBid, which translocates to the mitochondria
and induce its permeabilization. This will result in release of apoptogenic factors
from the mitochondria to the cytosol, such as cytochrome c, which will activate
caspase-3 through the apoptosome. Thus, type II cells need a signal
amplification step through the mitochondria. Death Receptor Antagonists are
proteins that are able to modulate Death Receptor activity. Among them,
Lifeguard (LFG), also called NMP35 or FAIM2, is a Fas antagonist highly
expressed in the nervous system. This protein has been characterized as a
Fas-induced apoptosis inhibitor, and it has been shown that localizes at postsynaptic
sites and dendrites. Moreover, it has been reported to interact directly
with Fas receptor in the lipid rafts and inhibit caspase-8 and caspase-3 activity
upon Fas activation. However, its mechanism of action has remained elusive. In
this work, we try to shed some light on this problem. First, previous results in
our lab have shown that LFG interacts with several proteins from the ubiquitin
system. We confirmed that LFG is ubiquitinated, and we also show that this
ubiquitination does not induce its degradation. In addition, we present data that
suggest that LFG ubiquitination is done in a non-canonycal way. On the other
hand, we make an extensive study to elucidate LFG subcellular localization. We
demonstrate that LFG localizes to ER and Golgi membranes, and to a lesser
extent, to endosomes. Since LFG is member of the TMBIM family proteins, that
are able to modulate Bcl-2 family activity, we investigated its relationship with
them, and found that it interacts with Bcl-xL and Bcl-2, through its C-terminal
region. Moreover, we prove that LFG protects only type II cells from Fasinduced apoptosis, and this protection is dependant on Bcl-xL endogenous
expression. Finally, our results reveal a hitherto undescribed step in the
signaling pathway in type II cells. Calcium mobilization from the ER has been
shown to be relevant in Fas apoptotic signaling. We demonstrate that LFG
modulates calcium release from the ER after Fas stimulation and inhibits Fasinduced
apoptosis in type II cells. On the basis of our observations, we propose
that LFG protects against Fas-induced apoptosis by modulating calcium release
from the ER.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UAB/oai:www.tdx.cat:10803/284973 |
| Date | 28 September 2014 |
| Creators | Urresti Ibáñez, Jorge |
| Contributors | Comella i Carnicé, Joan Xavier, 1963-, Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular |
| Publisher | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Source Sets | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Language | English |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 153 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | L'accés als continguts d'aquesta tesi queda condicionat a l'acceptació de les condicions d'ús establertes per la següent llicència Creative Commons: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/es/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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