La permeasa de melibiosa (MelB) és un cotransportador de la membrana d'Escherichia coli que transporta activament disacàrids (ex. melibiosa) utilitzant com a font d'energia un gradient transmembrana de Na +, Li + o H +. S'ha proposat una estructura de 12 α-hèlix transmembrana amb el costat N- i C-terminal a la cara citoplasmàtica. Estudis anteriors han proposat que el lloc d'unió dels cations dins la permeasa estaria formant per els quatre residus aspàrtics: D19, D55, D59 i D124. S'ha observat que la mutació de qualsevol d'aquests aspàrtics a cisteïna impedeix el transport de sucre acoblat a sodi. No obstant això, no s'ha realitzat estudis de la interacció d'aquests mutants amb el sodi i per tant la participació d'aquest aspàrtics en el lloc d'unió del catió és encara provisional. En aquest treball s'ha estudiat la implicació d'aquest residus aspàrtics en el lloc d'unió dels cations. S'ha expressat, purificat i reconstituït en liposomes els mutants D19C, D55C, D59C, D124C, i D59E. El mutant N58C també s'ha preparat i estudiat, ja que d'acord amb altres estudis de l'asparagina 58 també pot estar implicada en la unió del catió. S'ha utilitzat la tècnica d'espectroscòpia infraroja amb reflexió total atenuada que permet obtenir informació sobre l'efecte de la mutació en la interacció dels cations i/o la melibiosa amb la MelB.S'han realitzat espectres de diferència que s'han obtingut al fer passar una solució amortidora amb o sense substrat alternativament (per exemple, Na + i / o melibiosa), el procés s'ha realitzat repetidament. Els canvis en els espectres de diferència seran deguts a la interacció de la MelB amb el substrat. A causa del gran nombre de vibracions d'una proteïna que es poden observar per espectroscòpia d'infraroig, gairebé qualsevol interacció del substrat amb la MelB serà detectada per aquesta tècnica. Hem demostrat que els mutants D55C, D59C, D59E i N58C no interactuen amb Na+, ni en absència ni en presència de melibiosa. Per aquesta raó, proposem que aquests residus són lligands del Na+. D'altra banda, els mutants D19C i D124C preserven la capacitat d'interactuar amb el Na+, encara que el D124C presenta una menor intensitat en l'espectre de diferència degut a la interacció del sodi amb aquest mutant. Per tant, D19 no està involucrat en el lloc d'unió de Na+, en contrast amb els models anteriors, mentre D124 podria ser un lligand secundari responsable de l'acoblament catió-sucre. Finalment, dels mutants estudiats només D55C i D59C conserven la capacitat d'interaccionar amb la melibiosa, encara que amb algunes diferències respecte WT. Hem integrat tots aquests resultats experimentals en un model molecular de MelB, proposant un nou lloc d'unió del catió. / The melibiose permease (MelB) is a bacterial membrane protein that functions as an active secondary transporter. It couples the uphill transport of disaccharides (e.g., melibiose) with the co-transport of either H+, Na+, or Li+ down their electrochemical gradient. Evidence was obtained that this integral membrane protein consists of 12 transmembrane helices with the carboxyl- and amino-terminal located in the cytoplasm. Previous studies proposed a cation binding site consisting on four aspartic acid residues: D19, D55, D59 i D124. It was reported that mutation of any of these aspartics to cysteine prevents sodium-coupled sugar transport. Nevertheless, actual confirmation that mutation of these aspartic residues prevents cation binding has been lacking so far, and therefore their involvement in the cation binding site is still tentative. In the present study we sought to examine the implication of these aspartic acid residues in the cation binding site. We expressed, purified, and reconstituted in liposomes the MelB mutants D19C, D55C, D59C, D124C, and D59E. The mutant N58C was prepared and studied as well, since accordingly to some reports the asparagine 58 may be also implicated in the cation binding site. We applied attenuated total reflection Fourier transform infrared (ATR-FTIR) difference spectroscopy to detect and characterize the interaction of MelB mutants with the cation Na+ and the sugar melibiose. In this technique buffers without and with the substrate of interest (i.e., Na+ and/or melibiose) are repetitively cycled over the sample, and the changes in the protein vibrations emerging from the interaction with the substrate are measured. Due to the large number of IR active vibrations in a protein almost any interaction will be detectable by this technique. It is shown that the D55C, D59C, D59E and N58C mutants don't interact with Na+, neither in the absence nor in the presence of melibiose, and therefore these residues are most likely ligands of the Na+. On the other hand the D19C and D124C mutants preserve the ability to interact with Na+, although the later with significantly reduced spectral changes associated with this binding. Therefore, D19 is not involved in the Na+ binding site, in contrast to previous models, while D124 could be a secondary ligand responsible for the cation/sugar affinity coupling. Finally, from the studied mutants only D55C and D59C retained the ability to bind melibiose,, even though with some spectral differences to respect WT. We integrated all these experimental results in a molecular model of MelB, proposing a new cation binding site.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UAB/oai:www.tdx.cat:10803/3611 |
| Date | 29 July 2009 |
| Creators | Granell Puig, Meritxell |
| Contributors | Padrós, Esteve, Lórenz Fonfría, Víctor A., Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular |
| Publisher | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Source Sets | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Language | Catalan |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
Page generated in 0.0143 seconds