Fagmider är ett kraftfullt verktyg som använts för att uttrycka heterologa proteiner på fagvirus i metoder som exempelvis riktad evolution via fagdisplay av proteinbinliotek. Monovalent uttryck genom fagemider lider av ett överflöd av kala fager som är svåra att rensa bort. Effektiviteten hos detta system kan förbättras genom att använda tekniker för att selektivt fånga uttryckande fag. Biotinylering och infångning med streptavidin kan vara ett användbart verktyg för sådana ändamål och enzymatisk biotinylering med AviTag™-BirA-systemet är ett lovande alternativ. En fagemidvektor skapades genom amplifiering och kloning av sekvensen av AviTag™ in i en linjäriserad pAffi1#336-vektor. Sekvenser av två affikroppar, Zher2 och Zwt, som binder till två olika mål, Her2 och trastuzumab, klonades in i denna Avi-märkta vektor. Denna sammansatta fagemidvektor transformerades därefter till tre Escherichia coli-stammar: XL1Blue, ER2738, TG1. En plasmid innehållande BirA-enzym avsett för platsspecifik biotinylering av proteinerna som bär AviTag™ samtransformerades tillsammans med fagemiden i vissa transformationer för att undersöka biotinylering in vivo. Produktionsnivåerna för var och en av dessa stammar tillsammans med deras tillväxtkurvor beräknades för att analysera om plasmidbelastningen påverkar någon av stammarnas tillväxt. Det observerades att XL1Blue kunde växa i en takt som var jämförbar med de andra stammarna och samtidigt lyckades producera tillräckligt högre titrar. Superinfektion av hjälparfager för dessa produktioner var också mycket lovande. ER2738 och TG1 var avsevärt dåliga, den förra i termer av alla aspekter och den senare saknade bra superinfektionskarraktär men uppvisade anmärkningsvärt högre tillväxt och avsevärt högre titrar. Fagen biotinylerades in vitro genom att använda BirA som producerades och renades internt och dess biotinyleringsgrad jämfördes med den biotinylerade in vivo fagen som producerades i dessa tre stammar. Dessa fager utvärderades för deras förmåga att binda till sina mål och deras grad av biotinylering. Ett märkbart mönster som observerades fag visade minskad bindning till humant serumalbumin, vilket gjorde deras målbindning svår att tolka. / Phagemids have been a convenient and powerful tool used to display heterologous proteins on phage in methods such as directed evolution by phage display of protein libraries. Monovalent display through phagemids suffers from an overabundance of bald phage which are difficult to deplete. The efficiency of this system can be improved by using techniques to selectively capture expressing phage. Biotinylation and capture using streptavidin can be a useful tool for such purposes and enzymatic biotinylation using the AviTag™-BirA system is a promising option. A phagemid vector was created by the amplification and cloning of the sequence of AviTag™ into a linearized pAffi1#336 vector. Sequences of two affibodies, Zher2 and Zwt, binding to two different targets, Her2 and human IgG, were cloned into this Avi-tagged vector. This assembled phagemid vector was subsequently transformed into three Escherichia coli strains: XL1Blue, ER2738, TG1. A plasmid containing BirA enzyme intended for site-specific biotinylation of the proteins that carry the AviTag™ was co-transformed along with the phagemid in some transformations to investigate in vivo biotinylation. The production levels of each of these strains along with their growth curves were calculated to analyse if the plasmid burden impacts either of the strains’ growth. It was observed that XL1Blue was able to grow at a pace comparable to the other strains and managed to produce sufficiently high titers. The superinfection rate of these productions was also very promising. ER2738 and TG1 were considerably poor, the former in terms of all aspects and the latter only lacking in the superinfection rate but notable displaying higher growth and considerably higher titers. The phage was biotinylated in vitro by using BirA that was produced and purified in-house and its biotinylation degree was compared against the in vivo biotinylated phage that were produced in these three strains. The phage were then evaluated for their ability to bind to their targets and their degree of biotinylation. One noticeable pattern that was observed was that the Avi- tagged phage displayed reduced binding to the Human Serum Albumin which made their target binding hard to interpret.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UPSALLA1/oai:DiVA.org:kth-321568 |
| Date | January 2022 |
| Creators | Swaminathan, Barathram |
| Publisher | KTH, Proteinvetenskap |
| Source Sets | DiVA Archive at Upsalla University |
| Language | English |
| Detected Language | Swedish |
| Type | Student thesis, info:eu-repo/semantics/bachelorThesis, text |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | TRITA-CBH-GRU ; 2022:305 |
Page generated in 0.0023 seconds