SOUSA, D. O. B. Soyatoxina-2 - uma nova toxina de sementes de soja: aspectos estruturais, do mecanismo de ação e efeitos biológicos. 2006. 160 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2006. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-11-25T17:26:09Z
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Previous issue date: 2006 / Soyatoxin 2 (SYTX-2) is a toxic protein isolated from soybean seeds [Glycine max (L.) Merril], genotype BR-10, lethal to mice upon intraperitoneal injection (LD50 4.5 ± 0.1 mg/Kg body weight). The symptoms observed upon administration were pilloerection, tachycardia, paw and tail extending, diuresis and tonic-clonic convulsions prior to death. The SYTX-2 was purified from soybean crude extract by ammonium sulfate fractionation, ion-exchange (DEAE-cellulose), affinity (Sepharose-4B-trypsin) and gel filtration (Superdex 200HR 10/30) chromatography. Inclusion of 0.005 M dithiothreitol in the extracting and other buffers used during the purification process was crucial to obtain highly homogenous SYTX-2 and to preserve the toxicity. SYTX-2 is not a glycoprotein and has apparent molecular masses of 28.0 and 25.4 kDa as measured by SDS-PAGE and gel filtration in Superdex 200HR 10/30 column, respectively, and a molar extinction coefficient (ε1% 1cm) of 16.9. Its NH2-terminal sequence shows 75% identity with a class III acidic endochitinase from soybean seeds. Therefore, besides to its toxic properties, SYTX-2 presented chitinase activity of 1.34 nKat/mgP. This toxin, when in contact with the sciatic nerve of rats was able to increase the peak-to-peak amplitude, confirming its neurotoxic action. Moreover, SYTX-2 presented pro-inflammatory activity, inducing neutrophil migration into the peritoneal cavity of rats which peaked at 8 h after administration. Evaluation of its physiological role showed that SYTX-2 exerted negative effect on the development of the cowpea pest insect Callosobruchus maculates, particularly on adult emergence and in the mean larval development time. Additionally, SYTX-2 was toxic to Dysdercus peruvianus nymphs, as it caused reduction of both the body weight gain and survival rate. SYTX-2 also acted negatively on the root-knot nematode Meloidogyne incognita by hindering its mobility. On the other hand, SYTX-2 did not inhibit neither the spore germination nor the hyphal development of the phytopathogenic fungi Colletotrichum lindemuthianum, C. gloesporioides, Rhizoctonia solani, Cercospora kikuchii, Fusarium solani, F. oxysporum and Aspergillus niger, under the assay conditions carried out in this present work. In summary this study presents, for the first time, data on a neurotoxin protein with additional unusual chitinase activity, whose physiological role is likely related to the plant defense mechanisms. Accordingly, SYTX-2 possesses potential biotechnological application as a novel plant defensive agent against insect pests and parasitic nematodes. / Soyatoxina 2 (SYTX-2) é uma proteína tóxica isolada de sementes de soja [Glycine max (L.) Merril], genótipo BR-10, sendo letal para camundongos quando administrada por via intraperitoneal (DL50 4,5 ± 0,1 mg/Kg de peso corpóreo). Os sintomas observados após sua administração foram piloereção, taquicardia, estiramento de patas e da cauda, diurese e convulsões tônico-clônicas, que precederam a morte do animal. A SYTX-2 foi purificada do extrato bruto de soja por fracionamento com sulfato de amônio, cromatografias de troca iônica (DEAE-celulose), de afinidade (Sepharose-4B-tripsina) e de filtração em gel (Superdex 200HR 10/30). A inclusão de ditiotreitol 0,005 M no tampão de extração e em outros tampões utilizados durante o processo de purificação foi crucial para obtenção da SYTX-2 num estado altamente homogêneo e preservação da toxicidade. A SYTX-2 não é uma glicoproteína e apresenta massa molecular aparente de 28,0 e 25,4 kDa, quando avaliada por PAGE-SDS e filtração em gel em coluna de Superdex 200HR 10/30, respectivamente, e coeficiente de extinção molar (ε1%1cm) de 16,9. Sua seqüência NH2-terminal exibiu uma identidade de 75%, quando relacionada com aquela de uma endoquitinase acídica da classe III de sementes de soja. Ao lado de sua atividade tóxica, a SYTX-2 apresentou atividade quitinásica de 1,34 nKat/mgP. Essa toxina, quando em contato com o nervo ciático de ratos foi capaz de aumentar a amplitude pico-a-pico, comprovando sua ação neurotóxica. A SYTX-2 também mostrou atividade pró-inflamatória, induzindo migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal de ratos, cujo pico se deu 8 h após sua administração. Avaliação de seu papel fisiológico, mostrou que a SYTX-2 exerceu efeitos negativos sobre o desenvolvimento do inseto-peste de feijão-de-corda Callosobruchus maculatus, particularmente na emergência do adulto e no tempo médio de desenvolvimento larval. Adicionalmente, SYTX-2 foi tóxica para ninfas de Dysdercus peruvianus, causando redução no ganho de peso corpóreo e na taxa de sobrevivência. A SYTX-2 também atuou negativamente sobre o nematóide Meloidogyne incognita, impedindo sua mobilidade. Por outro lado, a SYTX-2 não foi capaz de inibir a germinação de esporos e nem o desenvolvimento de hifas dos fungos Colletotrichum lindemuthianum, C. gloesporioides, Rhizoctonia solani, Cercospora kikuchii, Fusarium solani, F. oxysporum e Aspergillus niger, nas condições de ensaio realizadas no presente trabalho. Em resumo, este trabalho apresenta, pela primeira vez, dados de uma proteína neurotóxica contendo uma atividade quitinásica não usual, cujo papel parece estar relacionado aos mecanismos de defesa da planta. Nesse contexto, SYTX-2 possui potencial para aplicação biotecnológica como um novo agente de defesa vegetal contra insetos-peste e nematóide-parasitas.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.repositorio.ufc.br:riufc/10425 |
| Date | January 2006 |
| Creators | Sousa, Daniele de Oliveira Bezerra de |
| Contributors | Vasconcelos, Ilka Maria |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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