Foram estudados a composição e o pH do meio de cultivo para a produção do fragmento de anticorpo (scFv) anti-LDL(-), expresso em Pichia pastoris recombinante. Os experimentos que definiram a composição e pH do meio assim como a concentração inicial de células na fase de indução foram realizados em agitador orbital a 250 rpm, com temperatura de 30 ºC na fase de crescimento e 20 ºC na fase de indução, durante 72 horas, com adição diária de 1% (v/v) de metanol. Para modificação do meio foi realizado um planejamento experimental empregando como variáveis independentes: extrato de soja, casaminoácidos e ureia, os quais substituíram o YNB e a biotina presentes no meio padrão (BMMY). Apesar de haver maior produção no meio com extrato de soja, o meio contendo 10 g.L-1 de casaminoácidos foi selecionado, uma vez que este favoreceu a etapa de purificação. A partir da faixa de pH estudada entre 3,0 e 8,0, determinou-se que o pH 8,0 no início da fase de indução favorece a maior produção. Finalmente, o meio BMMY-CA (pH 8,0) foi utilizado para cultivo em biorreator com volume de trabalho de 10L e a partir deste cultivo foram calculados os parâmetro cinéticos (velocidades de crescimento, de consumo de substrato e de produção, bem como produtividade). Diante do conjunto de experimentos realizados, foi possível otimizar a composição do meio de cultivo e as condições operacionais, que possibilitaram um aumento do rendimento bem como aumento do volume de produção do scFv anti-LDL(-) em biorreator. / Composition and pH culture medium for the production of anti- LDL(-) antibody fragment (scFv) were studied in recombinant yeast Pichia pastoris. The experiments that defined medium composition, pH and the initial cell concentration in the induction phase were carried out in baffled shaker flasks at 250 rpm, with temperature at 30°C for growth phase and 20°C for induction phase, during 72 hours with daily addition of 1% (v/v) methanol. A design of experiments employing for medium modification with independent variables: soy extract, casamino acids and urea, which replaced the YNB and biotin present in the standard medium (BMMY) was conducted for medium formulation. Even though, there was an increase in medium production with soy extract, the medium containing 10 g.L-1 casamino acids was selected since it favors the purification step. Through a pH range study (3.0 to 8.0), it was determined that pH 8.0 during induction phase offered higher levels. Then, the best results from shaker flask cultivation (BMMY-CA with casamino acids and pH 8.0) were carried out in 1L bioreactor, showing a biomass and a scFv production increase compared to the standard, BMMY (pH 6.0). Finally, the medium BMMY-CA (pH 8,0) was submitted to a volume scale-up into a 10L bioreactor, which was also used to evaluate kinetic parameters (rates of growth, substrate consumption and production as well as productivity). In conclusion, by optimizing culture medium and operating conditions it was possible to increase yield and scale-up the production of scFv anti-LDL(-) in bioreactor.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-10062014-084638 |
| Date | 28 March 2014 |
| Creators | Valker Araujo Feitosa |
| Contributors | Adalberto Pessoa Junior, Maria Filomena de Andrade Rodrigues, Marco Antonio Stephano |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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