Os patógenos de plantas são frequentemente classificados em biotróficos, necrotróficos ou hemibiotróficos de acordo com seu mecanismo de infecção e estilo de vida e, consequentemente, respostas distintas do hospedeiro são ativadas. As respostas da planta a patógenos são reconhecidamente reguladas por hormônios vegetais. Classicamente, considera-se que a sinalização por ácido salicílico (SA) é requerida para resistência a patógenos biotróficos, enquanto que a combinação de ácido jasmônico (JA) e etileno (ET) são requeridos para a resistência a necrotróficos. Com o objetivo de identificar mutantes e/ou transgênicos hormonais que apresentassem resposta diferencial contrastante à infecção pelos patógenos necrotrófico Sclerotinia sclerotiorum e biotrófico Oidium neolycopersici foi realizado um experimento com nove mutantes e transgênicos hormonais de tomateiro juntamente com o controle \'MT\'. Nesse screening foi concluído que o mutante sitiens, com reduzidos níveis de ácido abscísico (ABA), responde diferencialmente, apresentando maior suscetibilidade ao necrotrófico do que \'MT\' e resistência parcial ao fungo biotrófico. Evidências adicionais da participação do ABA nessas interações foram encontradas por meio da detecção no aumento no conteúdo de ABA em folhas de plantas inoculadas com ambos os patógenos, pelo aumento da expressão de GUS no transgênico RD29B::GUS, cujo promotor é responsivo ao ABA , e pela modulação da resistência com a aplicação exógena de 100 μM de ABA ou 2 μM de fluridone em \'MT\', em sitiens e no mutante sp12, com elevados níveis de ABA. Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar o papel da via biossintética de ABA na modulação do ciclo ascorbato-glutationa de antioxidação e remoção de H2O2, e do papel do ABA na alteração do perfil transcricional e protéico em folhas de tomateiro em resposta a infecção por S. sclerotiorum ou O. neolycopersici. sitiens apresenta elevados níveis de H2O2 no apoplasto, que parece resultar em morte celular programada (PCD). A presença dessa mutação interrompe a via de biossíntese do ABA, com provável acúmulo de intermediários, ocorrendo o consumo do ascorbato pela enzima violaxantina de-epoxidase (VDE) no cloroplasto. Com isso, esse ascorbato não é transportado para o apoplasto para a remoção de H2O2, o que auxilia no acúmulo de H2O2 e a consequente indução de PCD. A análise da expressão gênica diferencial por RNA-seq permitiu observar o enriquecimento de termos associados a grupos de genes induzidos relacionados a mecanismos de autofagia em \'MT\' inoculado com S. sclerotiorum. A autofagia é um tipo distinto de PCD e pode ser vista como uma estratégia de sobrevivência para evitar a extensiva morte celular, resultando no aumento da resistência a patógenos necrotróficos, como observado em \'MT\'. A análise proteômica permitiu verificar em \'MT\' uma maior abundância relativa de proteínas relacionadas a patogênese quando inoculadas com S. sclerotiorum. As proteínas encontradas em maior abundância relativa estão relacionadas a vias de sinalização do JA e ET, degradação da parede celular de fungos e de metabólitos secundários, conferindo uma maior resistência ao \'MT\'. Na interação com O. neolycopersici, foi verificada uma maior indução dos genes de resistência em sitiens e não foi detectado o enriquecimento de termos ligados a grupos de genes de autofagia em \'MT\'. Por outro lado, a análise de proteínas revelou a participação de uma endoquitinase em sitiens com papel presumível na resistência parcial a este patógeno biotrófico. Em conclusão, a via de biossíntese de ABA pode modificar a capacidade de remoção de H2O2 e ABA pode induzir a formas distintas de morte celular e regular a expressão de genes de resistência. / Plant pathogens are often classified as biotrophic, necrotrophic or hemibiotrophic according to their mechanism of infection and lifestyle and, consequently, distinct host responses are activated in each case. Plant responses to pathogens are known to be regulated by plant hormones. Classically, salicylic acid (SA) signaling is required for resistance to biotrophic pathogens, whereas the combination of jasmonic acid (JA) and ethylene (ET) are required for necrotrophic resistance. In order to identify mutant and/or hormonal transgenic plants that showed differential response to infection by the necrotrophic pathogens Sclerotinia sclerotiorum and biotrophic Oidium neolycopersici, an experiment was carried out with nine mutants and hormonal transgenic tomato plants together with the \'MT\' control. In this screen, the sitiens mutant, with reduced levels of abscisic acid (ABA), presented greater susceptibility to the necrotrophic fungus and partial resistance to the biotrophic fungus in comparison to \'MT\'. Further evidence of the participation of ABA in these interactions was given by the fact that ABA contents increased in leaves of plants inoculated with both pathogens, GUS expression increased in the transgenic RD29B :: GUS whose promoter is responsive to ABA, and resistance was modulated by the exogenous application of 100 μM ABA or 2 μM fluridone in \'MT\', sitiens and the sp12 mutant (high levels of ABA). The objective of this work was to investigate the role of the ABA biosynthetic pathway in the modulation of the ascorbate-glutathione cycle of antioxidation and H2O2 removal, and the role of ABA in altering the transcriptional and protein profile in tomato leaves in response to infection by S. sclerotiorum or O. neolycopersici. sitiens presents high levels of H2O2 in the apoplast, which appears to result in programmed cell death (PCD). The presence of this mutation interrupts the ABA biosynthesis pathway, with a probable accumulation of intermediates, with the use of ascorbate by the enzyme violaxanthin de-epoxidase (VDE) in the chloroplast. Thus, this ascorbate is not transported to the apoplast to remove H2O2, promoting the accumulation of H2O2 and the consequent induction of PCD. In \'MT\' inoculated with S. sclerotiorum, the analysis of differential gene expression by RNA-seq revealed the enrichment of terms associated with groups of induced genes related to mechanisms of autophagy. Autophagy is a distinct type of PCD and is a survival strategy to prevent extensive cell death, resulting in increased resistance to necrotrophic pathogens, as observed in \'MT\'. Proteomic analysis showed that \'MT\' presented a greater relative abundance of proteins related to pathogenesis when inoculated with S. sclerotiorum. These proteins are related to JA and ET signaling pathways, secondary metabolites and cell wall degradation of fungi, conferring greater resistance to \'MT\'. In the interaction with O. neolycopersici, increased induction of resistance genes was observed in sitiens and no enrichment of terms linked to groups of autophagy genes in \'MT\' was detected. On the other hand, protein analysis revealed the participation of an endochitinase in sitiens with a presumed role in the partial resistance to this biotrophic pathogen. In conclusion, the ABA biosynthetic pathway can modify the H2O2 removal capacity and ABA can induce distinct forms of cell death and regulate the expression of resistance genes.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-10102018-163324 |
| Date | 05 July 2018 |
| Creators | Silva, Jamille Santos da |
| Contributors | Figueira, Antonio Vargas de Oliveira |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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