O objetivo deste trabalho foi à purificação da toxina alfa produzida por Costridium perfringens tipo A em sistema de duas fases aquosas (SDFA) PEG/fosfato nos modos contínuo e descontínuo. Dois planejamentos fracionários sequenciais foram aplicados para estudar a partição da toxina alfa em SDFA, em função de 4 variáveis: massa molar e concentração do PEG, concentração do fosfato e pH. Os melhores resultados para o fator de purificação, rendimento em atividade e coeficiente de partição foram obtidos com PEG 8000 g/mol (15%, w/w), fosfato 20% (w/w) e pH 8.0. Este sistema permitiu um fator de purificação de 4,6 com rendimento em atividade de 230% e coeficiente de partição de 113,9 na fase PEG. Após isto, novos experimentos foram realizados para aperfeiçoar a purificação da toxina alfa com o emprego de um planejamento experimental completo 22. Nesta pesquisa a concentração do PEG 8000 g/mol e sais de fosfato pH 8,0 foram variados. O coeficiente de partição, fator de purificação e rendimento em atividade foram fortemente influenciados por estas variáveis. Aumentando ambos os fatores estudados, foi observado um aumento nas respostas, com exceção para o fator de purificação. O melhor fator de purificação (5,7) foi obtido com 17,5% e 15% das concentrações de PEG e fosfato, respectivamente. A coluna de discos perfurados rotativos (PRDC) foi usada para extrair toxina alfa a partir do sobrenadante com (PEG) (MM = 8,000 g/mol) e solução de sais de fosfato de sódio e de potássio (pH 8.0). Os resultados obtidos demonstraram que a velocidade de fluxo da fase dispersa (VD) de 3 Ml/min foi a melhor condição para as respostas hold up (ED = 0,8), eficiência de separação (ES = 100 %) e fator de purificação (Pf = 2,37), pois os melhores resultados foram obtidos nesta taxa de fluxo usando uma velocidade de rotação dos discos baixa (35 rpm), enquanto o melhor coeficiente de transferência de massa (KDa = 2,8 x10-3 min-1) foi encontrado na maior velocidade de rotação usada (140 rpm). / The aim this work was purification alpha-toxin (phospholipase C) produced by Costridium perfringens type A by aqueous two-phase systems (ATPS) PEG/phosphate in discontinue and continue mode. Two sequential half-fraction designs were applied to studying the ∝-toxin partition in ATPS, as a function of four factors: PEG molar mass and concentration, phosphate concentration and pH. The highest purification factor, yield and partition coefficient results were obtained with PEG 8000 (15%, w/w), phosphate at 20% (w/w) and pH 8.0. This system allows an ∝-toxin purification of 4.6 fold with final activity yield of 230% and partition coefficient of 113.9 in the PEG rich phase. After this, new experiments were realized for the optimization of ∝-toxin purification with employed of full experimental design. In this research the concentration of PEG 8000 g/mol and phosphate salts pH 8.0 were varied. The partition coefficient (K), purification factor (Pf) and activity yield (Y%) were strongly influenced for these variables. Increasing both factors was observed an increase of these responses, except for P Pf. The higher purification factor (5.7) was obtained with 17.5% and 15% of the PEG and phosphate concentration, respectively. A continuous perforated rotating disc contactor (PRDC) was used for extraction of ∝-toxin from the supernatant of Clostridium perfringens type A cultivations with polyethylene glycol (PEG) (MW = 8,000 g/mol) and dipotassium and sodium phosphate salt solution (pH 8.0). The results obtained demonstrated that VD = 3 L/min was by far the optimum dispersed phase flowrate for all these response variables. Besides, maximum values of ED (0.8), Es (100 %) and Pf (2.37) were obtained at this flowrate using the lowest rotational speed (35 rpm), while optimum KDa (2.8 x 10-3 min-1 ) was achieved at the highest agitation level (140 rpm).
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-22082017-165847 |
| Date | 13 December 2005 |
| Creators | Soares, Maria Taciana Cavalcanti Vieira |
| Contributors | Pessoa Junior, Adalberto |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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